تقييم القدرة على التكرار الفيروسي باستخدام مقايسة النسخ العكسي الموشومة إشعاعياً

الملخص

المصدر: Claiborne, D. T. et al. طريقة استنساخ تعتمد على إنزيمات التقييد لتقييم قدرة التضاعف In vitro للفيروسات الخيمرية Gag-MJ4 من النمط الفرعي C لفيروس HIV-1. J. Vis. Exp. (2014)

يوضح هذا الفيديو كيفية تقييم قدرة التكاثر الفيروسي باستخدام مقايسة النسخ العكسي المسمى إشعاعياً. تُضاف السوائل الطافية من المزارع التي تحتوي على الفيريونات الوليدة إلى خليط النسخ العكسي الذي يحتوي على نوكليوتيد مسمى إشعاعياً. تعكس الإشارة المدمجة المخرجات الفيروسية وكفاءة التكاثر. ويُستخدم التصوير الفسفوري للكشف عن الإشارات والمقارنة بين العينات المختبرة وعينات النوع البري.

البروتوكول

1. تحليل إنزيم النسخ العكسي (RT) في طافات المزارع الخلوية

1. قم بتجهيز خزانة سلامة بيولوجية في مرفق من المستوى الثالث للسلامة البيولوجية (BSL-3) لاستخدام المواد المشعة.
   1. ضع ورقاً ماصاً في الخزانة واستبدل جهاز الشفط بجهاز شفط مخصص للاستخدام المشع. 
      ملاحظة: يجب التخلص من جميع النفايات المشعة بشكل صحيح وفقاً للوائح السلامة.
2. أضف 1-2 µl من [α-³³P] deoxythymidine triphosphate (dTTP) بتركيز 10 mCi/ml و 4 µl من dithiothreitol (DTT) بتركيز 1 M إلى كل جزء بحجم 1 ml من المزيج الرئيسي لـ RT (انظر الجدول 1).
3. امزج بعناية كل أنبوب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5 ml يحتوي على المزيج الرئيسي لـ RT و DTT و [α-³³P] dTTP باستخدام ماصة سعة 1,000 µl وانقله إلى حوض معقم.
4. وزع 25 µl من مزيج RT المسمى في كل بئر من طبق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) رقيق الجدران ذي 96 بئراً. 
   ملاحظة: خصص مساحة لعينة ضابطة موجبة (عدوى MJ4 من النوع البري (WT)) وعينة ضابطة سالبة (عدوى وهمية (Mock infection)).
5. أضف 5 µl من كل سائل طافٍ إلى طبق PCR الذي يحتوي على المزيج الرئيسي لـ RT.
6. أغلق طبق PCR بغطاء من رقائق الألومنيوم اللاصقة واحضنه لمدة 2 hr عند 37 °C في جهاز التدوير الحراري. لأسباب تتعلق بالسلامة، اشطف رؤوس الماصة بمحلول Amphyl وتخلص من الرؤوس في حاوية صغيرة تحتوي على نفايات Amphyl، والتي سيتم التخلص منها لاحقاً مع النفايات المشعة.
7. بعد الاحتضان، اصنع ثقوباً صغيرة في غطاء الرقائق باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 200 µl. 
   ملاحظة: إذا لامست رؤوس الماصة السائل في البئر، فاستبدل الرؤوس قبل الانتقال إلى العمود أو الصف التالي.
8. امزج العينات 5 مرات وانقل 5 µl من كل عينة إلى ورق DE-81. اتركها تجف في الهواء لمدة 10 min.
9. اغسل اللطخات 5 مرات بمحلول saline-sodium citrate (SSC) بتركيز 1x، ثم مرتين باستخدام إيثانول بتركيز 90% لمدة 5 min لكل غسلة. اتركها تجف في الهواء.
   1. ضع كل لطخة في حاوية غسيل منفصلة، مثل صندوق تخزين الساندويتش، وأضف كمية كافية من محلول الغسيل المنظم (1x SSC أو إيثانول (EtOH) بتركيز 90%) لتغطية اللطخة، ورجها لمدة 5 min.
   2. اسكب محلول الغسيل في حاوية منفصلة وكرر العملية. ملاحظة: تُعتبر الغسلات الثلاث الأولى مشعة ويجب التخلص منها بشكل صحيح. أما الغسلتان الأخيرتان فيمكن التخلص منهما بشكل اعتيادي.
10. بمجرد أن تجف، لف اللطخة بعناية بغلاف Saran وعرضها لشاشة فسفورية في كاسيت محكم الإغلاق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
11. حلل الشاشات الفسفورية باستخدام جهاز التصوير الفسفوري (phosphorimager) وقم بقياس كمية النسخ المشعة.
12. ارسم دائرة حول كل إشارة مشعة باستخدام برنامج OptiQuant. قم بتمثيل قيم وحدة الضوء الرقمية (DLU) بيانياً لإنشاء منحنيات التضاعف.
13. من أجل حساب درجات قدرة التضاعف، تم تحويل قيم DLU لوغاريتمياً (log₁₀)، وحُسبت المنحدرات باستخدام النقاط الزمنية للأيام 2 و 4 و 6. ثم قُسمت منحدرات التضاعف على منحدر WT MJ4 لإنتاج درجات قدرة التضاعف. من المهم إجراء المعايرة (normalization) بناءً على قيم MJ4 WT التي تم الحصول عليها من نفس طبق RT لتقليل التباين داخل المقايسة.

الجدول 1: وصفة المزيج الرئيسي لمقايسة النسخ العكسي المسمى إشعاعياً.
ملاحظة: يُحفظ على شكل حصص سعة 1 ml عند -20 °C.

الكاشف	الحجم (مل)
H2O خالٍ من النيوكلييز2O	419.5
تريس-كلوريد، الرقم الهيدروجيني 7.8 (1 مولار)	30
كلوريد البوتاسيوم (1 مولار)	37.5
كلوريد المغنيسيوم (1 مولار)	2.5
Nonidet P-40 (10%)	5
EDTA (0.5 مولار)	1.02
حمض البولي أدينليك، ملح البوتاسيوم (٢ مجم/مل)	1.25
بادئ Oligo-dT (25 μg/ml)	3.25
الحجم الإجمالي	500

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كواشف الزرع الخلوي
منظف/مطهر Amphyl	Fisher	22-030-394
أحواض تجميع للماصات متعددة القنوات، 55 ml	Fisher	13-681-501
محلول Magnesium chloride بتركيز 1 M	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
كواشف مقايسة تقدير كمية النسخ العكسي
dTTP, [α-³³P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
Tris-Cl بتركيز 1 M، pH 8.0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	يجب ضبط الـ pH إلى 7.8 باستخدام KOH
Potassium chloride (KCl) بتركيز 2 M	Life Technologies/Invitrogen	AM9640G	يضبط ليكون محلولاً بتركيز 1 M
EDTA بتركيز 0.5 M	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
ملح البوتاسيوم لحمض Polyadenylic acid (Poly rA)	Midland Reagent Co.	P-3001
بادئ Oligo d(T)	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815-1G
شاشة فوسفورية عالية الدقة SR، صغيرة	Perkin-Elmer	7001485
لوح Corning Costar Thermowell بـ 96 بئراً، طراز (M) بولي كربونيت	Fisher	07-200-245	مُصنع بواسطة Corning Life
شريط إغلاق ألومنيوم للألواح الدقيقة بـ 96 بئراً من Corning، غير معقم	Fisher	07-200-684	مُصنع بواسطة Corning Life
ورق تبادل أنيوني DE-81	Whatman	3658-915
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Sodium Chloride	Fisher	S671-3
كاسيت التصوير الشعاعي الذاتي	Fisher	FB-CA-810
شاشة فوسفورية للتخزين Cyclone	Packard
جهاز الدورة الحرارية، PTC-200	MJ Research