تحضير العينات للتقدير الكمي الفيروسي المعتمد على اللوسيفيريز

الملخص

1. تحضير العينة يتم الحصول على عينات تحتوي على فيروس يعبر عن لوسيفيراز (على سبيل المثال VSV∆51-Fluc هنا) لتقدير العيار ونقلها إلى أطباق ذات 96 بئراً. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء العدوى في أطباق زراعة الأنسجة ذات 96 بئراً واستخدام السوائل الطافية مباشرة. تُترك بئران دون معالجة لإدراج منحنيات قياسية. بالنسبة للتجارب التي تُجرى مباشرة في أطباق ذات 96 بئراً، يتم تقدير العيار في نهاية التجربة (بعد 40 ساعة من العدوى) أو تُخزن عند -80 درجة مئوية ويتم تقدير العيار في تاريخ لاحق. 2. تحضير الخلايا المتقبلة لتقدير عيار الفيروس قبل 24 ساعة من تقدير العيار، يتم تحضير معلق من خلايا Vero بتركيز 2.5 × 10⁵ خلية/مل في وسط Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) يحتوي على 10% من مصل جنين البقر (FBS)، و30 ملي مولار من حمض 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، و1% من البنسلين/ستربتوميسين. ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم خلايا Vero، إلا أنه يمكن استخدام أي خط خلوي متقبل مناسب للعدوى بفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV). يتم استزراع 2.5 × 10⁴ خلية (100 ميكرولتر) في أطباق بيضاء ذات قاع مسطح وصلب وبها 96 بئراً باستخدام موزع الأطباق الدقيقة. يتم تحضير 12 مل من معلق الخلايا لكل طبق، بالإضافة إلى 5 مل للتحضير الأولي. تُنظف خرطوشة موزع الأطباق الدقيقة عن طريق غسل الأنابيب بـ 50 مل من الماء المعقم. تُملأ خطوط موزع الأطباق الدقيقة بمعلق الخلايا ويُترك 5 مل من معلق الخلايا للتدفق من خلالها. يتم اختيار برنامج يقوم بتوزيع 100 ميكرولتر في كل بئر من طبق أبيض الجدران ذي 96 بئراً. يتم التوزيع، وتكرار العملية حسب الضرورة للأطباق الإضافية. كما يتم استزراع بضع آبار في طبق شفاف ذي قاع مسطح وبها 96 بئراً إذا استُخدمت أطباق بيضاء الجدران ذات قاع عاتم للتحقق من صحة الخلايا وكثافتها. عند الانتهاء، تُدفع الخلايا عائدة إلى الوعاء الأصلي. تُنظف الخرطوشة بتمرير 50 مل من الإيثانول بتركيز 70%، يليه 50 مل من الماء المعقم الدافئ عبر الأنابيب. يجب التأكد من تنظيف الخرطوشة والأنابيب بشكل مناسب بين الاستخدامات. تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). 3. تحضير المنحنى القياسي الفيروسي يتم تحضير منحنى قياسي لـ VSV∆51-Fluc في وسط DMEM خالٍ من المصل بحيث يكون التركيز النهائي لوحدات تشكيل اللويحات (pfu) لكل مل بعد النقل إلى خلايا Vero كما يلي: 10⁸ و10⁷ و10⁶ و10⁵ و10⁴ و10³ و10² و10¹ وحدة تشكيل لويحة/مل. يتم تحضير 50 ميكرولتر من كل تركيز لكل طبق من خلايا Vero بالإضافة إلى زيادة قدرها 10%. ملاحظة: سيلزم تقييم عيار مخزون فيروس اللوسيفيراز بطريقة كلاسيكية لإنشاء منحنى قياسي يسمح بالتقدير الكمي المطلق. خلاف ذلك، يمكن تحقيق تقدير كمي نسبي دون معلومات دقيقة عن العيار من خلال تحديد عيار الفيروس تعسفياً بناءً على خطوات التخفيف. على سبيل المثال، يمكن تحديد التخفيف الأول للمنحنى القياسي بـ 10⁸ وحدة فيروسية، والتخفيف التالي بنسبة 1/10 بـ 10⁷، وهكذا. وفي هذا السياق، يجب التعبير عن القيم كـ "تغير مضاعف" (fold-change) مقارنة بعينة محددة مسبقاً، لأن التقدير الكمي المطلق لن يكون دقيقاً. 4. نقل السوائل الطافية للعينة إلى الخلايا المتقبلة تُفحص خلايا Vero المزروعة في الطبق ذي القاع الشفاف و96 بئراً تحت مجهر ضوئي للتأكد من أن الطبقات أحادية الخلية وصلت إلى حالة تلاقي بنسبة 95% على الأقل. يتم نقل 25 ميكرولتر من السائل الطافي للعينة إلى خلايا Vero المستزرعة في الأطباق بيضاء الجدران. لا تنقل السوائل الطافية إلى العمودين المخصصين للمنحنيات القياسية. ملاحظة: يمكن القيام بذلك في وقت واحد لجميع الآبار في طبق واحد باستخدام جهاز مناولة السوائل ذي 96 قناة. باستخدام ماصة متعددة القنوات (8 أو 12 قناة)، يتم إضافة 25 ميكرولتر من كل تخفيف للمنحنى القياسي المُحضّر في الخطوة 3 إلى خلايا Vero في العمودين المخصصين. تُوضع الأطباق في جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 430 x g في درجة حرارة الغرفة (RT). تُحضن لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2). غارسيا، ف.، وآخرونالتحتيت عالي الإنتاجية للفيروسات المعاد تركيبها المعبرة عن لوسيفيريز. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).

يوضح هذا الفيديو كيفية تحضير عينات المزارع الخلوية لتقييم الحمل الفيروسي باستخدام مقايسة تعتمد على لوسيفيراز. ويستعرض الفيديو عملية إصابة الخلايا الطلائية بفيروس معدل وراثياً، ونقل الرواشح الفيروسية والمعايير إلى آبار المقايسة، وتعزيز دخول الفيروس من خلال الطرد المركزي والحضن. ويعمل تعبير لوسيفيراز كبروتين مبلّغ، مما يسمح بقياس التركيز الفيروسي بناءً على مخرجات إشارة luminescence.

البروتوكول

1. تحضير العينات

1. احصل على عينات تحتوي على فيروس يعبر عن لوسيفيريز (على سبيل المثال VSV∆51-Fluc هنا) من أجل المعايرة وانقلها إلى أطباق ذات 96 بئراً. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء الإصابات في أطباق زراعة أنسجة ذات 96 بئراً واستخدام الرواشح مباشرة.
2. اترك عمودين بدون معالجة لإدراج منحنيات قياسية. بالنسبة للتجارب التي تُجرى مباشرة في أطباق ذات 96 بئراً، قم بالمعايرة في نهاية التجربة (بعد 40 ساعة من الإصابة) أو خزنها في درجة حرارة -80 °C وقم بالمعايرة في تاريخ لاحق.

2. تحضير الخلايا المتقبلة لمعايرة الفيروس

1. قبل 24 hr من عملية التعيير، قم بتحضير معلق من خلايا Vero بتركيز 2.5 x 10⁵ cells/ml في وسط Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) يحتوي على 10% fetal bovine serum (FBS)، و 30 mM من 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)، و 1% penicillin/streptomycin. 
   ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم خلايا Vero، إلا أنه يمكن استخدام أي خط خلوي مسموح به ومناسب لإصابة فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV).
2. قم بنثر 2.5 x 10⁴ cells (100 μl) في أطباق بيضاء ذات قاع مسطح وصلب تحتوي على 96 بئراً باستخدام موزّع الأطباق الدقيقة (microplate dispenser).
   1. حضّر 12 ml من معلق الخلايا لكل طبق، بالإضافة إلى 5 ml لعملية التجهيز الأولي (priming).
   2. نظّف خرطوشة موزّع الأطباق الدقيقة عن طريق غسل الأنابيب بـ 50 ml من الماء المعقم.
   3. املأ خطوط موزّع الأطباق الدقيقة بمعلق الخلايا واسمح بتدفق 5 ml من معلق الخلايا.
   4. اختر برنامجاً يقوم بتوزيع 100 μl في كل بئر من طبق ذو جدران بيضاء يحتوي على 96 بئراً. قم بالتوزيع، وكرر العملية حسب الحاجة للأطباق الإضافية. كما يجب نثر بعض الخلايا في بضع آبار في طبق شفاف ذو قاع مسطح يحتوي على 96 بئراً إذا تم استخدام أطباق ذات جدران بيضاء وقاع معتم للتحقق من صحة الخلايا وكثافتها.
   5. عند الانتهاء، قم بدفع الخلايا مرة أخرى إلى الحاوية الأصلية. نظّف الخرطوشة بتمرير 50 ml من الإيثانول بتركيز 70%، يليه 50 ml من الماء المعقم الدافئ عبر الأنابيب.
   6. تأكد من تنظيف الخرطوشة والأنابيب بشكل مناسب بين الاستخدامات.
3. قم بتحضين الخلايا لمدة 24 hr عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂.

3. تحضير منحنى القياس الفيروسي

1. قم بإعداد منحنى قياسي لـ VSV∆51-Fluc في وسط DMEM خالي من المصل بحيث يكون التركيز النهائي لوحدات تكوين اللويحات (pfu) لكل مل بعد النقل إلى خلايا Vero كما يلي: 10⁸ pfu/ml، و10⁷ pfu/ml، و10⁶ pfu/ml، و10⁵ pfu/ml، و10⁴ pfu/ml، و10³ pfu/ml، و10² pfu/ml، و10¹ pfu/ml. قم بتحضير 50 μl من كل تركيز لكل طبق من خلايا Vero بالإضافة إلى 10% إضافية.
   ملاحظة: يجب تقدير عيار مخزون فيروس اللوسيفيريز بطريقة تقليدية من أجل إنشاء منحنى قياسي يسمح بالتقدير الكمي المطلق. وخلاف ذلك، يمكن تحقيق التقدير الكمي النسبي دون معلومات دقيقة عن العيار عن طريق تحديد عيار الفيروس تعسفياً بناءً على خطوات التخفيف. على سبيل المثال، يمكن ضبط التخفيف الأول للمنحنى القياسي عند 10⁸ وحدة فيروسية، والتخفيف التالي بنسبة 1/10 عند 10⁷، وهكذا. وفي هذا السياق، ينبغي التعبير عن القيم كنسبة تغيير (fold-change) مقارنة بعينة محددة مسبقاً، لأن التقدير الكمي المطلق لن يكون دقيقاً.

4. نقل طافي العينات إلى الخلايا المتقبلة

1. افحص خلايا Vero المزروعة في طبق 96 بئراً ذا قاع شفاف تحت مجهر ضوئي للتأكد من أن الطبقات الأحادية قد وصلت إلى درجة تلاقي (confluent) بنسبة 95% على الأقل.
2. انقل 25 μl من supernatant العينة إلى خلايا Vero المزروعة في أطباق ذات جدران بيضاء. لا تنقل supernatants إلى العمودين المخصصين لمنحنيات القياس المعيارية. 
   ملاحظة: يمكن إجراء ذلك لجميع آبار الطبق الواحد في آن واحد باستخدام جهاز مناولة سوائل بـ 96 قناة.
3. باستخدام ماصة متعددة القنوات (8 أو 12 قناة)، أضف 25 μl من كل تخفيف من منحنى القياس المعياري الذي تم تحضيره في الخطوة 3 إلى خلايا Vero في العمودين المخصصين.
4. قم بطرد مركزي للأطباق لمدة 5 min عند 430 x g في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. حضن الأطباق لمدة 5 hr عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وسط Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	SH30243.01
مصل جنين البقر	NorthBio Inc.	NBSF-701
محلول ملحي منظم بالفوسفات	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	تحضير محلول بتركيز 1 mM، pH 7.3
أطباق ميكروية من البوليسترين معالجة للزراعة النسيجية، بيضاء صلبة ذات قاع مسطح وبـ 96 بئراً	Corning	3917	يمكن استخدام أطباق بـ 384 بئراً لزيادة الإنتاجية
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	قارئ أطباق ميكروية أحادي اللون
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	نظام ماصات يدوي بـ 96 طرفاً
رؤوس Liquidator96 LTS معقمة مع مرشحات	Mettler Toledo	LQR-200F	تعتبر أي رؤوس معقمة ومفلترة متوافقة مع الماصات المختارة مناسبة
Microflo	BioTek	111-206-21	يستخدم لتوزيع الخلايا في طبق بـ 96 بئراً
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	مقياس فلورية للأطباق الميكروية