توليد خلايا جذعية جنينية للفئران مصابة بالفيروس البطيء

الملخص

المصدر: كياريلا، أ. م. وآخرون، كبح نسخ الجينات عن طريق إعادة توجيه الآلية الخلوية باستخدام المعدلات الكيميائية فوق الجينية. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2018)

يوضح هذا الفيديو كيفية توليد خلايا جذعية جنينية للفئران معدلة وراثياً باستخدام ترانسدكشن الفيروسات البطيئة (lentiviral transduction). حيث تقوم جزيئات الفيروسات البطيئة بنقل علامة مقاومة للمضادات الحيوية، مما يسمح بالدمج الجينومي المستقر واختيار الخلايا التي خضعت للترانسدكشن.

البروتوكول

1. إصابة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (mESC) بالفيروس البطيء (Lentivirus)

1. يتم استزراع خلايا جسيمات الكروماتين المكيّفة الخالية من الخلايا المغذية، ذات الممرات المنخفضة (أقل من الممر 35) في الجسم الحي خلايا mESC المستخدمة في مقايسة الكروماتين في الجسم الحي (CiA) في وسط Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) الأساسي عالي الجلوكوز، والمُدعم بـ 20% من مصل جنين البقر (FBS) المخصص لخلايا ESC، و10 ملي مولار من حمض 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازين إيثان سلفونيك (HEPES)، و1x من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، والبنسلين/ستربتوميسين (Pen/Strep)، و2-مركابتويثانول، وعامل تثبيط لوكيميا (LIF) بنسبة تخفيف 1:500 في... 37 °C حضّانة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)₂.
   ملاحظة: يتم الحصول على عامل تثبيط اللوكيميا (LIF) من الطافي الخاص بخلايا Cos المنتجة لـ Lif-1C-alpha ‏(COS LIF)، والتي تُجمع في دفعات وتُجمد عند -80 °C.
   1. تُزرع الخلايا في أطباق سبق تحضينها لمدة تتراوح بين 1 إلى 3 ساعات باستخدام جيلاتين بنسبة 0.1% في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) بتركيز 1x، ثم غُسلت بعد ذلك بمحلول 1x PBS. يتم تزويد الخلايا بالوسط الغذائي يومياً، وتُقسم كل 2 إلى 3 أيام، وذلك حسب كثافتها.
      ملاحظة: من الناحية المورفولوجية، يجب أن تكون مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية (ES) صغيرة ومستديرة ومنفصلة عن بعضها البعض.
2. انقل الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (mESC) إلى طبق بـ 12 بئراً (100,000 خلية/بئر) قبل يوم واحد من العدوى.
   1. قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). وبالنسبة للخلايا المنماة في أطباق بقطر 10 سم، يتم سحب الوسط القديم، وإضافة 5 مل من محلول PBS بتركيز 1x، ثم سحب محلول PBS وإضافة 1 مل من التريبسين بتركيز 0.25%. تُحضن الخلايا في التريبسين لمدة 8 دقائق عند 37 °Cمع هز الخلايا والنقر عليها في منتصف فترة التحضين. والهدف من هذه الخطوة هو تحويل الخلايا إلى معلق خلوي أحادي.
3. بعد 48 ساعة من تغيير الوسط الغذائي لخلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK) من نوع 293T في أطباق قياس 15 سم، قم بإزالة الطافي ونقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
4. قم بطرد السائل الطافي مركزياً عند 300 x g لمدة 5 دقائق لترسيب حطام الخلايا.
5. قم بترشيح السائل الطافي عبر غشاء بمسامية 0.45-µm غشاء.
   ملاحظة: تأكد من استخدام أغشية أسيتات السليلوز الخالية من المواد الخافضة للتوتر السطحي (SFCA)، حيث يمكن لبعض المواد الأخرى أن تحجز الفيروس وتؤدي إلى خفض الإنتاجية بشكل كبير.
6. ركّز الفيروس باستخدام جهاز الطرد المركزي الفائق، بواسطة جهاز طرد مركزي مزود بدوار من طراز SW32، مع تدويره بسرعة 20,000 دورة في الدقيقة (~72,000 x g) لمدة 2.5 ساعة عند درجة حرارة 4 °C.
7. أثناء تركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق، عـالج خلايا mESC من نوع CiA في طبق ذي 12 بئراً باستخدام وسط ES جديد يحتوي على 5 µg/mL من البوليبيرين.
8. عند الانتهاء من تركيز الفيروس، اسحب الطافي بعناية وعلّق ركازة الفيروس في 100 µL من محلول 1x PBS (مع تجنب تكون فقاعات زائدة).
9. أضف الفيروس ومحلول 1x PBS إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. استخدم جهاز المزيج الدوامي (Vortex) أو رج الأنبوب عند 300 x g (أو عند أدنى إعداد) لتعليق الفيروس بشكل كامل. قم بتدوير الأنبوب في جهاز طرد مركزي صغير لسطح المكتب لمدة 5 - 10 ثوانٍ لإزالة الفقاعات.
10. أضف 30 µL من الفيروس إلى كل بئر في طبق مكون من 12 بئرًا. قم بتدوير الطبق، ثم قم بطرده مركزيًا عند 1,000 x g لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن تغيير كمية الفيروس المضافة بناءً على العيار الفيروسي، والذي يرتبط عكسياً بحجم بنية النقل.
    1. بدلاً من ذلك، يمكن تجميد الفيروس تجميداً سريعاً باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه في درجة حرارة -80 °Cومع ذلك، فإن تجميد الفيروس سيؤدي إلى خفض العيار الفيروسي.
11. أعد لوحة الـ 12 بئراً إلى 37 °C الحاضنة، واستبدل الوسط في صباح اليوم التالي (بعد حوالي 16 ساعة) بوسط ES جديد.
12. بعد مرور 48 ساعة من العدوى، يتم انتقاء الخلايا التي دمجت البلازميد الفيروسي عن طريق إضافة المضاد الحيوي المناسب (على سبيل المثال، 1.5 µg/mL من البوروميسين، 10 µg/mL من البلاستيسيدين، إلخ). غيّر الوسط الغذائي يومياً واغسل الخلايا بـ 1x PBS إذا كانت غالبية الخلايا طافية أو ميتة. أبقِ وسط الانتقاء على الخلايا لمدة تتراوح بين 72 و96 ساعة في 37 °C حضّانة تحتوي على 5% CO2₂.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
DMEM	Corning	10-013CV
NEAA	Gibco	11140-050
HEPES (للزراعة النسيجية)	Corning	25-060-Cl
FBS	Atlantic Biologicals	S11550	تم اختبار تشغيلات فردية للجودة
أنابيب طرد مركزي للفيروسات	Beckman Coulter	344058
غشاء ترشيح الفيروسات	Corning	431220
Polybrene	Santa Cruz Biotechnology	SC134220
Trypsin 0.25 %	Gibco	25200-056	مع EDTA
Trypsin 0.05 %	Gibco	25400-054	مع EDTA
Puromycin	InvivoGen	ant-pr
جهاز طرد مركزي فائق	Optima	XPN-80
دوار جهاز الطرد المركزي SW-32	Beckman Coulter	14U4354
دلاء جهاز الطرد المركزي SW-32 Ti	Beckman Coulter	130.2
LentiX 293 خلايا كلية جنينية بشرية	Clontech	632180
PBS	Corning	46-013-CM
CiA:Oct4 mESC	هدية كريمة من G. Crabtree
خلايا Cos المنتجة لـ Lif-1C-alpha	هدية كريمة من J. Wysocka