تحديد الخلايا المصابة بفيروس الفاكسينيا المؤتلف باستخدام الانتقاء الأيضي والفلوري

الملخص

توليد الفيروسات المؤتلفة وفقاً للشكل 1، يتم إصابة طبقة أحادية من خلايا BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (خط خلوي طلائي من كلية القرد مشتق من خلايا CV-1)] بفيروس vaccinia في وسط خالٍ من المصل بمعدل عدوى (MOI) > 1. وبعد ساعة واحدة من الإصابة، يتم إنقاذ الخلايا باستخدام وسط dulbecco's modified eagle medium (DMEM) وإجراء ترانسفكشن (transfection) بخليط من بلازميد ناقل إعادة الائتلاف وكاشف الترانسفكشن بنسبة 3:1 في وسط خالٍ من المصل. بعد 24 ساعة، تُكشط الخلايا وتُستعاد في وسط DMEM لا يحتوي على مصل جنين البقر (FBS)، ثم تُجرى ثلاث دورات من التجميد والإذابة لتمزيق الخلايا وتحرير الجسيمات الفيروسية. يُجرى مقايسة اللويحات (plaque assay) باستخدام غطاء سائل من DMEM يحتوي على 10% FBS وكواشف اختيار GPT (Guanine Phosphoribosyltransferase (من E. coli))، وهي حمض mycophenolic (بتركيز 25 ميكروغرام/مل) والزانثين (بتركيز 250 ميكروغرام/مل) على النحو التالي: يتم استزراع طبق ذو 6 آبار بطبقة أحادية من خلايا BS-C-1. تُصاب الطبقات الأحادية من الخلايا ذات الالتحام الكامل (100%) بتخفيفات متسلسلة من الخلايا المجمدة والمذابة التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية لضمان الفصل الكافي بين اللويحات الفردية. تُغطى الخلايا بسائل DMEM يحتوي على 10% FBS وكواشف اختيار GPT - حمض mycophenolic والزانثين بتركيزات نهائية تبلغ 25 ميكروغرام/مل و250 ميكروغرام/مل، على التوالي. بعد تحضين لمدة 24 ساعة، يُزال الغطاء السائل ويُستخدم مجهر فلوري للبحث عن اللويحات التي تظهر فلورة حمراء منتشرة تتوافق مع دمج mCherry من ناقل TDS (transient dominant selection) في الفيروس. وبناءً على الجين المستهدف والوسم الفلوري المختار، قد تُلاحظ أيضاً فلورة موضعية للجين الموّسم في اللويحة الحمراء نفسها. يتم التقاط لويحات متعددة لكل فيروس مؤتلف عن طريق الكشط الموضعي باستخدام طرف ماصة و100 ميكرولتر من DMEM يحتوي على 5% FBS لنقل الخلايا إلى أنبوب Eppendorf، يتبع ذلك ثلاث جولات من التجميد والإذابة للخلايا المكشوطة لتحرير الفيروسات المؤتلفة. يُضاف DMEM الذي يحتوي على الفيروس المجمد والمذاب إلى طبقة أحادية من الخلايا في طبق ذو 12 بئراً لتضخيم الفيروسات المؤتلفة باستخدام كواشف اختيار GPT في وسط النمو. تُكشط عمليات التضخيم الناجحة بعد 24 ساعة من الإصابة. تُجرى مقايسة اللويحات للويحات المضخمة بنجاح والتي تظهر فلورة حمراء، ولكن هذه المرة باستخدام غطاء من الأغاروز واختيار GPT، على النحو التالي: يتم استزراع طبق ذو 6 آبار بطبقة أحادية من خلايا BS-C-1. يُجرى تخفيف متسلسل للفيروسات المؤتلفة وتُصاب الآبار بتخفيفات متزايدة من الفيروسات في وسط DMEM خالٍ من FBS. بعد ساعة واحدة من الإصابة، يُزال الوسط السائل ويُغطى كل بئر بـ 0.5% أغاروز في وسط أساسي أدنى (MEM) يحتوي على 2.5% FBS، و292 ميكروغرام/مل L-glutamine، و100 وحدة/مل بنسيلين، و100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين، جنباً إلى جنب مع كواشف اختيار GPT. بعد 2-3 أيام من الإصابة، يتم اختيار اللويحات التي تظهر فلورة باللونين الأحمر ولون الوسم الفلوري المختار لتضخيمها مرة أخرى، وهذه المرة بدون اختيار GPT. تُجرى مقايسة اللويحات التالية باستخدام غطاء أغاروز بدون اختيار. يتم التقاط اللويحات التي فقدت فلورتها الحمراء المنتشرة ولكنها احتفظت بالفلورة الموضعية المقابلة للوسم المختار. يستمر تنقيه اللويحات بدون اختيار للحصول على مخزون نقي من الفيروسات المؤتلفة التي فقدت جينات mCherry وgpt الاختيارية ولكنها احتفظت بالفلورة الموضعية المقابلة للوسم المختار. يتم التحقق من نقاء المخزونات عن طريق مقايسة اللويحات؛ حيث يجب أن تظهر جميع اللويحات نمطاً ظاهرياً متشابهاً. مرزوق، ن. ب.، وآخرون، منهجية التوليد الفعال لبروتينات فيروس الجدري (Vaccinia Virus) الموسومة فلورياً. مجلة جيو في إكسب (J. Vis. Exp.) (2014)

يوضح هذا الفيديو كيفية إنتاج فيروسات vaccinia مأشوبة باستخدام إعادة التركيب المتجانس بوساطة البلازميد في الخلايا الظهارية المصابة. وتتيح العلامات الفلورية والأيضية عملية اختيار وتحديد الفيروسات التي تعبر عن البروتينات الموصومة.

البروتوكول

توليد الفيروس المعاد تركيبه

1. وفقاً لـ الشكل 1، قم بإصابة طبقة أحادية من خلايا BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (خط خلوي ظهاري من كلية القرد مشتق من خلايا CV-1)] باستخدام فيروس الفاكسينيا في أوساط خالية من المصل وبمضاعفة عدوى (MOI) > 1.
2. بعد ساعة واحدة من العدوى، يتم إنقاذ الخلايا باستخدام وسط دولبيكو المعدل من وسط إيجل (DMEM)، ثم تُجرى عملية عفن (transfection) باستخدام خليط من بلازميد ناقل إعادة الائتلاف وكاشف عفن بنسبة 3:1 في وسط خالٍ من المصل.
3. بعد مرور 24 ساعة، تُكشط الخلايا وتُستعاد في وسط DMEM لا يحتوي على مصل جنين البقر (FBS)، ثم تُجرى ثلاث دورات من التجميد والإذابة لتمزيق الخلايا وتحرير الجسيمات الفيروسية.
4. أجرِ مقايسة لويحات باستخدام تغطية سائلة من وسط DMEM المحتوي على 10% من مصل الجنين البقري (FBS) وGPT (ناقل غوانين فسفو ريبوزيل ترانسفيراز (من E. coliكواشف الانتقاء، حمض الميكوفينوليك (25 µg/ml)، والزانثين (250 µg/mlعلى النحو التالي:
   1. قم بزراعة طبقة أحادية من خلايا BS-C-1 في طبق زراعة مكون من 6 آبار.
   2. قم بإصابة طبقات أحادية من الخلايا المتلاحمة بنسبة 100% بتخفيفات متسلسلة من الخلايا التي خضعت لدورات التجميد والإذابة والمحتوية على الجسيمات الفيروسية، وذلك لضمان الفصل الكافي بين اللويحات الفردية.
   3. تُغطى بطبقة سائلة من وسط DMEM المحتوي على 10% من FBS وكواشف الانتقاء GPT - حمض الميكوفينوليك والزانثين بتركيزات نهائية تبلغ 25 µg/ml و 250 µg/mlعلى التوالي.
5. بعد تحضين لمدة 24 ساعة، يتم إزالة الطبقة السائلة العلوية واستخدام مجهر فلوري للبحث عن اللويحات التي تظهر فلورة حمراء منتشرة، وهو ما يشير إلى دمج mCherry من ناقل الاختيار السائد المؤقت (TDS) في الفيروس. وبناءً على الجين المستهدف والوسم الفلوري المختار، قد تُلاحظ أيضاً فلورة موضعية للجين الموُسم في اللويحة الحمراء نفسها.
6. التقط عدة لويحات لكل فيروس معاد التركيب عن طريق الكشط الموضعي باستخدام رأس ماصة و 100 µl من وسط DMEM المحتوي على 5% من مصل جنين البقر (FBS) لنقل الخلايا إلى أنبوب Eppendorf، يليه إجراء ثلاث دورات من التجميد والإذابة للخلايا المكشوطة لتحرير الفيروسات المؤشبة.
7. أضف وسط DMEM الذي يحتوي على الفيروس المذاب بالتجميد والذوبان إلى طبقة أحادية من الخلايا في طبق ذي 12 بئراً لتضخيم الفيروسات المؤشبة باستخدام كواشف اختيار GPT في وسط النمو. قم بكشط عمليات التضخيم الناجحة بعد 24 ساعة من العدوى.
8. أجرِ مقايسة اللويحات للويحات التي تم تضخيمها بنجاح وتظهر فلورة حمراء، وذلك باستخدام غطاء من الأجاروز واصطفاء GPT هذه المرة، على النحو التالي:
   1. ازرع طبقة أحادية من خلايا BS-C-1 في طبق ذي 6 آبار.
   2. أجرِ تخفيفاً تسلسلياً للفيروسات المؤشبة، ثم أصِب الآبار بتخفيفات متزايدة من الفيروسات في وسط DMEM خالٍ من مصل الجنين البقري (FBS).
   3. بعد ساعة واحدة من العدوى، قم بإزالة الوسط السائل وتغطية كل بئر بطبقة من الآجاروز بتركيز 0.5% في وسط أساسي أدنى (MEM) يحتوي على 2.5% من مصل جنين البقر (FBS)، 292 µg/ml وL-glutamine بتركيز 292 ميكروجرام/مل، وبنسلين بتركيز 100 وحدة/مل، و 100 µg/ml ستريبتومايسين، جنباً إلى جنب مع كواشف اختيار GPT.
9. بعد يومين إلى 3 أيام من العدوى، يتم اختيار اللويحات التي تظهر تألقاً باللون الأحمر ولون الوسم الفلوري المختار لإعادة تضخيمها، وهذه المرة دون استخدام كواشف اختيار GPT.
10. أجرِ مقايسة اللويحات التالية باستخدام طبقة تغطية من الأجاروز دون استخدام عوامل اصطفاء.
11. اختر اللويحات التي فقدت تألقها الأحمر المنتشر ولكنها لا تزال تحتفظ بالتألق الموضعي المقابل للوسم المختار.
12. استمر في تنقية اللويحات دون استخدام عوامل انتخاب للحصول على مخزون نقي من الفيروسات المؤتلفة التي فقدت جينات الانتخاب mCherry وgpt ولكنها احتفظت بالفلورة الموضعية المقابلة للوسم المختار. تحقق من نقاء المخزونات عن طريق مقايسة اللويحات؛ إذ يجب أن تظهر جميع اللويحات نمطاً ظاهرياً لويحياً مماثلاً.

النتائج

الشكل 1. مخطط للإجراء التجريبي لإنشاء فيروس فكسينيا مأشوب. تظهر الأحداث التي تقع على المستويين الجيني والخلوي، إلى جانب صور تمثيلية للبقع الفيروسية توضح الخطوات التي تلي إنشاء فيروس فكسينيا فلوري مُوسوم بـ A3-GFP. (Aتُنقل ناقلات إعادة الاندماج TDS إلى الخلايا المصابة بفيروس vaccinia.Bفي هذا الشكل، تم تصوير نتيجة إعادة الارتباط من الجهة اليسرى فقط، ويستخدم المثال GFP كعلامة فلورية مختارة. أما إعادة الارتباط من الجهة اليمنى فستؤدي إلى دمج بلازميد TDS بالكامل في الجينوم بطريقة مماثلة، باستثناء أن العلامة ستندمج مع الجين المستهدف بالكامل في الخطوة الوسيطة، أي، الخطوة ج. يُجرى مقايسة لويحات على طبقة أحادية من الخلايا باستخدام مزيج إعادة الائتلاف، وتُخضع لانتخاب GPT. (جيتم اختيار اللويحات التي تظهر كلاً من الفلورة الحمراء والخضراء، والتي تقابل التعبير عن mCherry وGFP على التوالي، ومن ثم يتم تضخيمها. وبمجرد إزالة عملية الانتخاب، سيحدث فقدان للفلورة الحمراء، وهو ما يقابل فقدان الـ gpt و mCherry جينات (د)، ويتم التقاط اللويحات التي تظهر فلورة خضراء حصرياً وتكثيرها (E).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حمض الميكوفينوليك (Mycophenolic acid)	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	يُذاب في 0.1 N NaOH
كزانثين (Xanthine)	Sigma-Aldrich	X0626-5G	يُذاب في 0.1 N NaoH
كاشف ترانسفكشن FuGENE HD	Promega	E2311
مجهر فلوري مجهز بمرشحات Chroma 31001، 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)