- ترنسدكشن الفيروس الغداني وتعطيل البروتين الداخلي عن طريق ترنسفكشن الحمض النووي الريبي المتدخل الصغير (siRNA) في خلايا HeLa-RFP-H2B باستخدام رواسب فوسفات الكالسيوم (CaPi)
ملاحظة: فيروس غدي ضابط يحمل جيناً غير مرتبط (أي، يُستخدم (LacZ) أو لا يُستخدم أي جين للوصول إلى أدنى تعددية عدوى (MOI) في جميع عمليات العدوى الغدية (Adenofections) (10-20 وحدة تشكيل لويحة (PFU)/خلية) باستخدام أقل كمية من الفيروس الغدي المؤتلف الذي يحمل الجين المستهدف.
ملاحظة: لقد ثبت أن هذا الإجراء يساعد في توحيد مستوى التعبير لكل خلية في تجمعات خلوية كبيرة.
- بعد يوم واحد من زراعة الخلايا، قم بعدّ الخلايا في طبق زراعة إضافي. اشفط الوسط واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 mL من 0.05% Trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). أضف مرة أخرى 1 mL من 0.05% Trypsin/EDTA واحضن الخلايا عند 37 °C و5% CO₂ حتى تنفصل جميع الخلايا. افصل الخلايا جيداً باستخدام ماصة 1 mL وعدّ عدد الخلايا لكل mL باستخدام مقياس كرات الدم (haemocytometer).
- حدد كمية الفيروس المطلوبة لنقل الجينات إلى الخلايا بمعدل عدوى (MOI) يبلغ 2 PFU من البروتين المستهدف (POI) لكل خلية و18 PFU لكل خلية من ناقل فارغ (مثل LacZ) ليكون المجموع 20 PFU لكل خلية. في الوقت ذاته، انقل 4 PFU من كل فيروس باكولوفي (baculovirus) يشفر للأكتين المسمى بالبروتين الفلوروسنتي الأخضر (GFP) وα-tubulin المسمى بالبروتين الفلوروسنتي الأحمر (RFP). انقل الجينات إلى الخلايا باستخدام بروتوكول adenofection التالي.
- قم بتحضير أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 mL لكل حالة في غطاء معقم وأضف 400 μL من وسط alpha minimum essential medium (αMEM) الدافئ.
- قم بإذابة عينة من الفيروسات ببطء على الثلج، وإذا لزم الأمر، خفف مخزون الفيروس لتمكين سحب حجم أكبر من 1 μL لتقليل أخطاء الماصة.
- أضف كمية الفيروس المحسوبة لكل حالة إلى كل أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 mL يحتوي على 400 μL αMEM واخلط بلطف باستخدام الماصة. أعد مخزون الفيروس فوراً إلى -80 °C للحفاظ على نشاطه.
- اشفط الوسط من الخلايا وأضف خليط الفيروس بلطف على شكل قطرات بالماصة. احضن الخلايا عند 37 °C و5% CO₂ ورج الأطباق بعناية تحت الغطاء المعقم كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة لضمان تغطية الخلايا جيداً بالفيروس. يساعد استخدام كمية صغيرة من الوسط في تسهيل تلامس الفيروس مع الخلايا.
- بعد الحضن، أضف بلطف 1.6 mL αMEM إلى كل طبق للحصول على حجم إجمالي قدره 2 mL، وابدأ عملية تزامن الخلايا بإضافة 2 mM thymidine واحضن الخلايا لمدة ساعتين إضافيتين عند 37 °C و5% CO₂.
- في هذه الأثناء، قم بتحضير خليط ترانسفكشن siRNA باتباع طريقة CaPi (انظر الشكل 1). إذا لم يكن siRNA ضرورياً، استبدل كمية siRNA بالماء المعقم لإجراء ترانسفكشن فارغ.
- احسب 200 μL من الخليط لكل حالة، مما ينتج عنه 400 μL لكل مكرر. المثال التالي معطى لتركيز نهائي من siRNA يبلغ 50 nM ويجب تكييفه لكل بروتين مستهدف. في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 mL، اسحب 50 μL من 1 M CaCl2 و11 μL من 20 μM siRNA في 139 μL من H2O المعقم واخلط باستخدام جهاز الفورتكس (vortexing). بعد عملية تدوير قصيرة (spin)، أضف بعناية 200 μL من 2× HEPES-buffered saline (HBS2x) (280 mM NaCl, 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.5 mM Na₂HPO₄, pH 7.01-7.05) على شكل قطرات.
ملاحظة: كلما كانت القطرات أصغر، كانت الرواسب أصغر، مما يؤدي إلى كفاءة ترانسفكشن أفضل. اخلط بلطف ثلاث مرات عن طريق حقن الهواء باستخدام ماصة 200 μL. - احضن الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). أضف ببطء 200 μL من خليط الترانسفكشن إلى كل طبق ورج الأطباق بشكل عرضي. انقل الأطباق إلى 37 °C و5% CO₂ لمدة 16 ساعة.
- في اليوم التالي، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 2 mL من HEPES الدافئ (6.7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3) وأضف 2 mL αMEM. لا تتعامل مع أكثر من أربعة أطباق خلايا في وقت واحد لأن التباينات في درجة الحرارة تؤثر على طول دورة الخلية.
- عاين كفاءة العدوى باستخدام مجهر فلوروسنتي مقلوب بتكبير 20-40x (هواء) والتقط ثلاث صور تمثيلية لكل حالة في كل من القنوات الفلوروسنتية والنافذة للتوثيق. بعد سبع ساعات، أضف 2 mM thymidine واحضن لمدة 16 ساعة إضافية عند 37 °C و5% CO₂.
- في اليوم التالي، بعد 48 ساعة من ترانسفكشن siRNA والعدوى الفيروسية، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 2 mL من phosphate-buffered saline (PBS) الدافئ واتركها لمدة 7 ساعات في 2 mL αMEM بدون Phenol Red للتصوير الحي للخلايا أو مع Phenol Red لاستخلاص البروتين.
- احصد الخلايا لكل حالة بعد 48 ساعة من الترانسفكشن لتحضير مستخلصات البروتين وتحليل Western blot لتحديد كفاءة الإسكات (knockdown) وتعبير البروتين الداخلي.
ملاحظة: استخدم أجساماً مضادة ضد البروتين المستهدف بالإضافة إلى أجسام مضادة مناسبة تعمل كضوابط تحميل (loading controls). يجب تحديد كفاءة الإسكات عن طريق تحميل كميات متناقصة من محللات الخلايا الضابطة (التي تم عمل ترانسفكشن لها باستخدام siRNA ضابط) لتوفير منحنى معايرة (على سبيل المثال: 1، ½، ¼، ⅛).
