وسم بقايا السيستين المتاحة على السطح في الجسيمات الشبيهة بالفيروسات المهندسة

الملخص

1. تلقيح الفيروس وتنقية الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) من نباتات Nicotiana benthamiana إنتاج نسخ T7-RNA ذات نهايات محمية (capped) من بلازميدات ناقلة تعتمد على فيروس البطاطس X (PVX) وتحمل جينات البروتين الغلافي (CP) من النوع البري (wt) والنوع الطافر في السيستين لفيروس Maize rayado fino (MRFV)، وذلك باستخدام طقم Ambion's T7-mMessage mMachine. لكل تفاعل نسخ T7، يتم تلقيح ورقتين مكتملتي النمو من نبات N. benthamiana بـ 10 ميكرولتر من نواتج التفاعل، وتُحضن النباتات لمدة 10 أيام في دفيئة زراعية، عند رطوبة 60% لمدة 16 ساعة من الإضاءة (25,000-30,000 لوكس) عند درجة حرارة 25 درجة مئوية، و8 ساعات من الظلام عند 20 درجة مئوية. تُجمع الأوراق المصابة بالفيروس من نبات N. benthamiana بعد 10 أيام من التلقيح (dpi)، ويُوزن نسيج النبات (50 جراماً) ويوضع على الثلج. يُجانس المادة النباتية في خلاط بوجود 100 مل من محلول مبرد من منظم سترات الصوديوم بتركيز 0.5 مولار ورقم هيدروجيني (pH) 5.5 (استخدم 2 مل من المنظم لكل جرام من نسيج النبات). يُرشح المتجانس عبر 3 طبقات من الشاش، ويُنقى عن طريق الطرد المركزي عند 27,000 × g لمدة 30 دقيقة. يُنقل السائل الطافي إلى مخبار مدرج مبرد، ويُقاس الحجم، ثم يُنقل إلى دورق مخبري معقم ومبرد. يتم التخلص من الراسب. تُعالج العينة الطافية بإضافة 10% من البولي إيثيلين جليكول 8,000 (PEG 8,000)، وتُقلب لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، ثم تُحضن لمدة 45 دقيقة إضافية عند 4 درجات مئوية لترسيب مصفوفة الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs)-PEG. تُطرد العينة مركزياً عند 27,000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ويُزال السائل الطافي. يُعالج الراسب بإضافة 8 مل من منظم سترات الصوديوم بتركيز 0.05 مولار ورقم هيدروجيني (pH) 5.5، يحتوي على 2% من Triton X-100. تُرج أنابيب الطرد المركزي جيداً لتحرير الراسب. يُنقل الراسب والمنظم إلى دورق مخبري معقم ومبرد. تُشطف الأنابيب فوراً بـ 2 مل من المنظم نفسه وتُضاف إلى الدورق. يُقلب المعلق عند 4 درجات مئوية حتى تذوب الرواسب (عادةً لمدة ساعة واحدة). يُنقى المعلق بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 27,000 × g، ويُتخلص من الراسب، ثم يُعالج السائل الطافي بالطرد المركزي عند 140,000 × g لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية. يُعاد تعليق الراسب في 1 مل من منظم سترات الصوديوم بتركيز 0.05 مولار ورقم هيدروجيني (pH) 5.5، ويوضع المعلق فوق تدرج سكروز بنسبة 10-40% مُحضر في منظم سترات الصوديوم بتركيز 0.05 مولار ورقم هيدروجيني (pH) 5.5. يُطرد التدرج مركزياً لمدة 3 ساعات عند 140,000 × g عند 4 درجات مئوية. يُسلط ضوء فوق الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي، وتُجمع الحزمة العلوية المشتتة للضوء على بُعد 4 سم من أعلى الأنبوب، وتُخفف بمنظم سترات الصوديوم بتركيز 0.05 مولار ورقم هيدروجيني (pH) 5.5، ثم تُطرد مركزياً لمدة 3 ساعات عند 140,000 × g عند 4 درجات مئوية. يُعاد تعليق الراسب في 0.5 مل من الماء المعقم ويُحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. يتم قياس تركيز الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) بإجراء مقايسة برادفورد للبروتين. يتراوح عائد الجسيمات الشبيهة بالفيروسات بين 1 و3 ميكروجرام/جرام من نسيج النبات. 2. تفاعلات وسم الجسيمات الشبيهة بالفيروسات بـ fluorescein-5-maleimide تُحضر محلول بتركيز 1 ملي مولار من fluorescein-5-maleimide (427.37 جم/مول) في منظم فوسفات الصوديوم بتركيز 50 ملي مولار، ورقم هيدروجيني (pH) 7.0، و1 ملي مولار من حمض إيثيلين ثنائي الأمين رباعي الخليك (EDTA). يُمزج المحلول باستخدام جهاز الرج الدوامي (vortex) ويُتأكد من الذوبان التام. يُحمى الأنبوب من الضوء باستخدام ورق ألومنيوم. يُضاف fluorescein-5-maleimide إلى الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) المنتجة في الخطوة 1 ويُمزج الخليط. يُستخدم فائض مولي بمقدار 25 ضعفاً من fluorescein-5-maleimide بالنسبة للكمية المولية من مجموعات السلفهيدريل. وبشكل عام، فإن استخدام 30 ميكرولتر من الجسيمات الشبيهة بالفيروسات بتركيز 1 ميكروجرام/ميكرولتر و60 ميكرولتر من محلول fluorescein-5-maleimide يعطي نتائج مقبولة. يُحضن التفاعل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. يُوقف التفاعل بإضافة dithiothreitol (DTT) ليصل التركيز النهائي إلى 50 ملي مولار. يُزال الـ fluorescein غير المتفاعل باستخدام عمود دوران لإزالة الأملاح (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) وبالطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 1,500 × g في درجة حرارة الغرفة. لتحليل الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد بنظام دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE)، تُضاف 10 ميكرولتر من منظم عينات Laemmli الخاص بـ SDS-PAGE بتركيز 2 × إلى 10 ميكرولتر من كل تفاعل. يُحفظ البروتين الموّسم محمياً من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد، أو في حصص فردية (aliquots) عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. ناتييا، أ.، وهاموند، ر. و. تحليل إمكانية وصول المذيب إلى بقايا السيستين في الجسيمات الشبيهة بالفيروس لـ Maize rayado fino virus المنتجة في نباتات Nicotiana benthamiana والربط التشابكي للببتيدات بالجسيمات الشبيهة بالفيروس. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2013)

يوضح هذا الفيديو عملية الوسم الفلوري لمواقع محددة في جسيمات شبيهة بالفيروسات (VLPs) طافرة تم إنتاجها في نبات Nicotiana benthamiana باستخدام صبغة تفاعلية مع الثيول، يتبع ذلك التنقية والترحيل الكهربائي للهلام لتأكيد التعديل السطحي.

البروتوكول

1. تلقيح الفيروس وتنقية الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) من نباتات Nicotiana benthamiana

1. إنتاج نسخ T7-RNA ذات نهايات محمية (capped) من بلازميدات ناقلة تعتمد على فيروس البطاطس X (PVX) وتحمل جينات البروتين الغلافي (CP) من النوع البري (wt) والنوع الطافر في السيستين لفيروس Maize rayado fino (MRFV)، باستخدام مجموعة T7-mMessage mMachine من Ambion.
2. لكل تفاعل نسخ T7، يتم تلقيح ورقتين ممتدتين بالكامل من نبات N. benthamiana بـ 10 μL من تفاعلات النسخ، وتحضين النباتات لمدة 10 أيام في الدفيئة، عند رطوبة 60% لمدة 16 ساعة من الضوء (25,000-30,000 lux) عند 25 °C و 8 ساعات من الظلام عند 20 °C.
3. حصد أوراق N. benthamiana المصابة بالفيروس بعد 10 أيام من التلقيح (dpi)، ووزن الأنسجة النباتية (50 غراماً) ووضعها على الثلج.
4. تجنيس المادة النباتية في خلاط بوجود 100 mL من محلول مبرد من منظم Na-Citrate تركيز 0.5 M، وبقيمة pH 5.5 (استخدام 2 mL من المنظم لكل غرام من الأنسجة النباتية).
5. ترشيح المستحلب عبر 3 طبقات من الشاش، وتصفيته عن طريق الطرد المركزي عند 27,000 × g لمدة 30 دقيقة. يُنقل الطافي إلى مخبار مدرج مبرد، ويُقاس الحجم، ثم يُنقل إلى بيكر معقم ومبرد. يتم التخلص من الراسب.
6. معالجة الطافي بإضافة 10% من البولي إيثيلين جلايكول 8,000 (PEG 8,000)، والتقليب لمدة 15 دقيقة عند 4 °C، ثم التحضين لمدة 45 دقيقة إضافية عند 4 °C لترسيب مصفوفة الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs)-PEG.
7. طرد العينة مركزياً عند 27,000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 °C وإزالة الطافي.
8. معالجة الراسب بإضافة 8 mL من منظم Na-Citrate تركيز 0.05 M، وبقيمة pH 5.5، يحتوي على 2% Triton X-100. تُرج أنابيب الطرد المركزي جيداً لتحرير الراسب. يُنقل الراسب والمنظم إلى بيكر معقم ومبرد. تُشطف الأنابيب فوراً بـ 2 mL من المنظم نفسه وتُضاف إلى البيكر. يُقلب المعلق عند 4 °C حتى تذوب الرواسب (ساعة واحدة عادةً).
9. التصفية عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 27,000 × g، والتخلص من الراسب، ومعالجة الطافي عن طريق الطرد المركزي عند 140,000 × g لمدة ساعتين عند 4 °C.
10. إعادة تعليق الراسب في 1 mL من منظم Na-Citrate تركيز 0.05 M، وبقيمة pH 5.5، ووضع المعلق فوق تدرج سكروز بنسبة 10-40% مُعد في منظم Na-Citrate تركيز 0.05 M، وبقيمة pH 5.5.
11. طرد التدرج مركزياً لمدة 3 ساعات عند 140,000 × g عند 4 °C.
12. تسليط الضوء على الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي وجمع النطاق العلوي المشتت للضوء عند مسافة 4 cm من أعلى الأنبوب، وتخفيفه باستخدام منظم Na-Citrate تركيز 0.05 M، وبقيمة pH 5.5، وطردها مركزياً لمدة 3 ساعات عند 140,000 × g عند 4 °C.
13. إعادة تعليق الراسب في 0.5 mL من الماء المعقم وتخزينه عند 4 °C لمدة تصل إلى ستة أشهر.
14. تحديد كمية تركيز VLPs من خلال إجراء مقايسة بروتين برادفورد (Bradford protein assay). يتراوح إنتاج VLPs بين 1 و 3 μg/g من الأنسجة النباتية.

2. تفاعلات وسم الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) باستخدام الفلوريسين-5-ماليميد

1. قم بتحضير محلول بتركيز 1 mM من الفلوريسين-5-ماليميد (427.37 g/mole) في محلول منظم من فوسفات الصوديوم بتركيز 50 mM، وpH 7.0، و1 mM من حمض إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA). اخلط المزيج باستخدام جهاز vortex وتحقق من الذوبان الكامل. احمِ الأنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
2. أضف الفلوريسين-5-ماليميد إلى الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) التي تم إنتاجها في الخطوة 1 واخلطها. استخدم فائضاً مولياً بمقدار 25 ضعفاً من الفلوريسين-5-ماليميد بالنسبة للكمية المولية لمجموعات السلفهيدريل. عموماً، يؤدي استخدام 30 μL من VLPs بتركيز 1 μg/μL و60 μL من محلول الفلوريسين-5-ماليميد إلى نتائج مقبولة.
3. قم بتحضين التفاعل لمدة 2 hr في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 °C.
4. أوقف التفاعل بإضافة ديثيوثريتول (DTT) حتى يصل التركيز النهائي إلى 50 mM.
5. أزل الفلوريسين غير المتفاعل باستخدام عمود دوران لإزالة الأملاح (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) وبالطرد المركزي لمدة 2 min عند 1,500 × g في درجة حرارة الغرفة.
6. لتحليل الفصل الكهربائي للهلام بـ بولي أكريلاميد وكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE)، أضف 10 μL من محلول عينة Laemmli لـ SDS-PAGE بتركيز 2 × إلى 10 μL من كل تفاعل. خزن البروتين المسمى محمياً من الضوء عند 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد، أو في حصص أحادية الاستخدام عند -20 °C لمدة تصل إلى 3 أشهر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنابيب رقيقة الجدران فائقة الوضوح	Beckman	344059
طقم mMESSAGE mMACHINE T7	Life Tecnologies	AM1344M
فلوريسين-5-ماليميد	Thermo Scientific Life Technologies	46130 F150	المنتج 46130 غير متوفر، استبدله بـ F150
منظم Laemmli	Bio-Rad	1610737
منظم التشغيل Tris Glycine SDS (سلفات دوديسيل الصوديوم)	Invitrogen	LC2675
منظم النقل Tris Glycine	Invitrogen	LC3675
ورق ترشيح غشاء النيتروسليلوز (ساندوتش)	Invitrogen	LC2001
EZ-Link Maleimide-Polyethylene glycol (PEG) 2-Biotin، صيغة بدون وزن	Thermo Scientific	21901