إصابة الفئران بفيروس هيربس الفئران عن طريق الأنف لتقييم الاستجابات المناعية للمضيف

الملخص

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تضمنت نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية في JoVE. 1. إفراز السيتوكينات بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) في الفئران المصابة بفيروس γHV68 يتم تخدير فئران من سلالة C57BL/6 (B6) متطابقة الجنس، تتراوح أعمارها بين 6-8 أسابيع ومن نفس البطن (8-12 فأراً/مجموعة)، عن طريق حقن 1.5 مجم من الكيتامين/ 0.12 مجم من الزيلازين داخل الصفاق، ثم يتم تلقيحها عن طريق الأنف بـ 40 وحدة تشكيل لويحة (PFU) من فيروس γHV68 في 40 ميكرولتر. وفي نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة، يتم قتل الفئران رحمةً باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO2) يليه خلع الرقبة. يُفتح الصدر بقطع جانبي أيسر على طول عظم القص، وتُقص الضلوع باستخدام مقصات حادة، ثم يتم جمع أنسجة الرئة. تُجمع نصف أنسجة الرئة (الفص الأيسر) في أنابيب معقمة ذات غطاء لولبي سعة 1.5 مل تحتوي على خرز من الزركونيا/السيليكا بحجم 1.0 ملم وكمية 500 ميكرولتر. يُضاف 1 مل من وسط DMEM (وسط دولبيكو المعدل من وسط إيجل) البارد والخالي من المصل إلى الأنبوب، ويتم تجنيس أنسجة الرئة عن طريق ضرب الخرز لمدة 30 ثانية. تُبرد الأنابيب على الثلج لمدة دقيقتين وتُكرر هذه العملية مرة واحدة. تُوضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي (15,000 x g لمدة 10 دقائق) عند درجة حرارة 4 مئوية، ويُجمع السائل الطافي ويُقاس إنتاج السيتوكينات كما هو موضح أدناه. تُقاس السيتوكينات باستخدام أطقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) المتاحة تجارياً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تشانغ، ج.، وآخرون. ب. تشريح إشارات المناعة الفطرية في التهرب الفيروسي من إنتاج السيتوكينات. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2014)

يوضح هذا الفيديو عملية التوصيل عبر الأنف لفيروس الهربس الفأري في الفئران لتحفيز استجابة مناعية خاصة بالرئة. يتم بعد ذلك معالجة أنسجة الرئة للحصول على رواسب علوية تحتوي على السيتوكينات لتقييم الاستجابات المناعية للمضيف في المراحل اللاحقة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تضمنت نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية في JoVE.

1. إفراز السيتوكينات بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) في الفئران المصابة بـ γHV68

1. يتم تخدير فئران من سلالة C57BL/6 (B6) متوافقة الجنس، تبلغ من العمر 6-8 أسابيع من نفس البطن (8-12 فأراً/مجموعة) عن طريق حقن 1.5 mg من ketamine/0.12 mg من xylazine داخل الصفاق، ثم تُلقح عن طريق الأنف بـ 40 PFU(Plaque-forming unit) من γHV68 في 40 µl. وفي نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى، يتم القتل الرحيم للفئران باستخدام استنشاق CO₂ يليه خلع الرقبة.
2. يُفتح الصدر عن طريق قطع جانبي أيسر على طول عظمة القص، وتُقطع الأضلاع باستخدام مقص حاد. ثم تُجمع أنسجة الرئة.
3. يُجمع نصف نسيج الرئة (الفص الأيسر) في أنابيب معقمة سعة 1.5 ml ذات أغطية لولبية تحتوي على 500 µl من خرزات Zirconia/Silica بحجم 1.0 mm. يُضاف 1 ml من وسط DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) البارد الخالي من المصل إلى الأنبوب، ويُجانس نسيج الرئة عن طريق الضرب بالخرز (bead-beating) لمدة 30 sec. تُبرد الأنابيب على الثلج لمدة 2 min وتُكرر هذه العملية مرة واحدة.
4. تُوضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي (15,000 x g لمدة 10 min) عند درجة حرارة 4 °C، ويُجمع السائل الطافي ويُقاس إنتاج السيتوكين كما هو موضح أدناه.
5. يتم قياس السيتوكينات باستخدام أطقم ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) للسيتوكينات المتاحة تجارياً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
طقم مقايسة ELISA لـ CCL5 في الفئران	R&D Systems	DY478
خرز Zirconia/Silica بحجم 1.0 mm	BioSpec Products	11079110z