الوظائف الفلورية للجزيئات الشبيهة بالفيروسات عبر إعادة جسر ثنائي الكبريتيد

الملخص

المصدر: Chen, Z., et al. صنع جسيمات شبيهة بالفيروسات مفسفرة ومفلورة محفزة بالاقتران عن طريق كيمياء ثنائي بروموماليميد-ثنائي الكبريتيد. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو الوظيفية الفلورية للجسيمات الشبيهة بالفيروسات عن طريق إعادة جسر الروابط ثنائية الكبريتيد المختزلة باستخدام رابط البولي إيثيلين جليكول (PEG)، مما ينتج مترافقات مستقرة وقابلة للتتبع مناسبة للتصوير الخلوي والتوصيل المستهدف في التطبيقات الطبية الحيوية.

البروتوكول

1. ربط مركبات ثنائي بروموماليميد (DB) على العاثية Qβ

1. اختزال الروابط ثنائية الكبريتيد في Qβ.
   1. أذب 0.0020 g من tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) في 1 mL من الماء عالي النقاء لتحضير محلول مخزون بتركيز 100x.
      ملاحظة: حضّر TCEP طازجاً قبل عملية الاختزال.
   2. أضف 200 µL من Qβ (بتركيز 5 mg/mL) في أنبوب طرد مركزي دقيق.
   3. اتبع ذلك بإضافة 20 µL من محلول TCEP المخزون بتركيز 100x.
   4. قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 h.
2. إعادة ربط ثنائيات الكبريتيد المختزلة باستخدام dibromomaleimide polyethylene glycol (DB-PEG).
   1. أذب 0.0017 g من dibromomaleimide-polyethylene glycol (DB-PEG) في 100 µL من DMF.
   2. أضف 680 µL من محلول فوسفات الصوديوم بتركيز 10 mM (عند pH 5).
   3. أضف Qβ المختزل إلى محلول DB-PEG وراقب عملية الخلط تحت مصباح UV (فوق بنفسجي) بطول موجي 365 nm. يمكن رؤية الفلورة الصفراء الساطعة فوراً باستخدام مصباح UV محمول بطول موجي 365 nm عند الخلط.
   4. اترك التفاعل يستمر طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT) على جهاز تدوير (rotisserie).
3. قم بتنقية خليط التفاعل بواسطة مرشح طرد مركزي (حد قطع الوزن الجزيئي (MWCO) = 10 kDa) ثلاث مرات باستخدام 1x PBS (محلول ملحي منظم بالفوسفات) عند 3,283 x g لمدة 20 min عند 4 °C.
4. راقب عملية الاقتران بواسطة SDS-PAGE (الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد ودوديسيل كبريتات الصوديوم) غير المختزل والرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز الأصلي (native agarose gel electrophoresis).
   ملاحظة: تتحرك VLPs (الجسيمات الشبيهة بالفيروسات) كجسيمات سليمة في هلام الأجاروز الأصلي، ويتم فصلها بناءً على شحنتها وحجمها وشكلها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2,3-Dibromomaleimide 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
بولي إيثيلين جلايكول	Alfa Aesar	41561-22
فوسفات الصوديوم	Fisher Scientific	AC424375000
أكريلاميد/بيس-أكريلاميد	P212121	RP-A11310-500.0
دوديسيل كبريتات الصوديوم	Sigma Aldrich	L3771-100G
برسلفات الأمونيوم	Fisher Scientific	BP179-100
وحدات ترشيح بالطرد المركزي Amicon Ultra-4	Millipore Sigma	UFC801024
أنبوب طرد مركزي مخروطي Falcon سعة 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
أنبوب طرد مركزي دقيق: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
هزاز مداري VWR Os-500	VWR Scientifc Products	14005-830
ماصة P1000 Pipetman	Gilson	F123602
ماصة P200 Pipetman	Gilson	F123601
ماصة P100 Pipetman	Gilson	F123615
ماصة P20 Pipetman	Gilson	F123600
ماصة P10 Pipetman	Gilson	F144802
ميزان مختبري عالي الدقة Intel Weighing PM-100 Laboratory classic	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100