التحضير الآمن لعينات الفيروسات للمجهر الإلكتروني النافذ

الملخص

المصدر: Blancett, C. D.، وآخرون. استخدام الكبسولات للصبغ السلبي للعينات الفيروسية داخل الاحتواء البيولوجي. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو الطريقة الآمنة لتحضير العينات الفيروسية المخصصة للمجهر الإلكتروني النافذ. يتم تثبيت الجسيمات الفيروسية باستخدام الجلوتارالدهيد، وصباغتها بعامل كثيف إلكترونياً، ثم إخضاعها للتثبيت بالبخار باستخدام رباعي أكسيد الأوزميوم لتثبيت البنى وضمان التعطيل الكامل، مما يضمن التعامل الآمن مع العينات الفيروسية مع تحسين التباين للحصول على صور عالية الجودة عبر المجهر الإلكتروني النافذ TEM.

البروتوكول

1. طريقة الكبسولة للصبغ السلبي في مناطق الاحتواء البيولوجي باستخدام الجلوتارالدهيد المائي والتعطيل ببخار رباعي أكسيد الأوزميوم 1%

1. داخل كابينة السلامة البيولوجية (BSC) الخاصة بالاحتواء البيولوجي، اسحب 40 µL من معلق الفيروس إلى الكبسولة المتصلة بالماصة.
   ملاحظة: تظل الماصة متصلة بالكبسولة حتى تكتمل العملية.
2. ضع الماصة على جانبها لمدة 10 min مع توجيه الشبكات أفقيًا؛ وذلك لتعزيز التوزيع المتساوي لجزيئات الفيروس على الشبكات المطلية.
3. قم بتعطيل الفيروس داخل الكبسولة داخل كابينة السلامة البيولوجية الخاصة بالاحتواء البيولوجي.
   1. ارفع الماصة واضغط على المكبس لتفريغ محلول الفيروس في حاوية النفايات.
   2. اسحب 40 µL من مثبت الجلوتارالدهيد (glutaraldehyde) بتركيز 2% إلى الكبسولات. تنبيه: الجلوتارالدهيد مادة كيميائية خطرة وتتطلب حماية مناسبة. يمكن استخدام الجلوتارالدهيد لفترات قصيرة في كابينة سلامة بيولوجية عادية، ولكن يتطلب استخدام الكاشف وهو مفتوح لفترات طويلة العمل في كابينة سلامة بيولوجية ذات قناة طرد أو غطاء fume hood كيميائي.
   3. ضع الماصة على جانبها لمدة 20 min لضمان تثبيت العينات جيدًا.
   4. اطرد المثبت واسحب 40 µL من الماء منزوع الأيونات (DI water) إلى الكبسولات لغسل المثبت. كرر خطوة الغسل هذه لإجمالي 3 دورات شطف.
4. اسحب 40 µL من خلات اليورانيل (UA) بتركيز 1% أو حمض الفوسفوتنجستيك للبوتاسيوم (PTA) بتركيز 1% إلى الكبسولات واتركها لمدة 30 s.
   ملاحظة: قد يختلف وقت التلوين من 10 s إلى 1 min بناءً على عينة الفيروس.
   تنبيه: خلات اليورانيل (UA) هي مصدر لإشعاعات ألفا وسم تراكمي؛ لذا يجب التعامل معها باستخدام وسائل حماية مناسبة.
5. أخرج الكبسولة من الماصة وجفف الشبكات عن طريق لمس قطعة من ورق الترشيح لحافة الشبكات بينما تظل الشبكات داخل الكبسولة.
6. إجراء التعطيل ببخار رباعي أكسيد الأوزميوم.
   1. ضع الكبسولة، والغطاء مفتوح، في أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL يحتوي على ورق ترشيح مغموس في محلول رباعي أكسيد الأوزميوم بتركيز 1%. تنبيه: رباعي أكسيد الأوزميوم شديد السمية وله ضغط بخاري منخفض. يجب استخدامه في كابينة سلامة بيولوجية ذات قناة طرد أو غطاء fume hood كيميائي. تعامل معه باستخدام حماية مناسبة، وقم بنشر معلومات تحذيرية في منطقة العمل.
   2. أغلق أنبوب الطرد المركزي سعة 50 mL لمدة 1 h للسماح بالتغلغل الكامل لبخار رباعي أكسيد الأوزميوم. بعد ذلك، قم بتطهير الأنبوب ونقله من وحدة الاحتواء البيولوجي إلى مرفق المجهر الإلكتروني (EM) من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (BSL-2).
7. أخرج شبكات المجهر الإلكتروني (EM) من الكبسولة.
   1. في مرفق المجهر الإلكتروني (EM) من المستوى BSL-2، أخرج الكبسولة من أنبوب الطرد المركزي وضعها على الماصة.
   2. اسحب 40 µL من الماء منزوع الأيونات (DI water) إلى الكبسولة وفرغ الماء في حاوية النفايات ثلاث مرات.
   3. أخرج الكبسولة من الماصة وجفف الشبكات باستخدام ورق الترشيح لمس حافة الشبكات.
   4. بعد التجفيف بالهواء، احفظ الشبكات من أجل التصوير اللاحق بالمجهر الإلكتروني النافذ (TEM).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
شبكات TEM مغطاة بـ Formvar/carbon	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
كبسولات mPrep/g	EMS	85010-01	box
وصلات mPrep/f	EMS	85010-11	standard 16/Pk
Glutaraldehdyde	EMS	16320	محلول بتركيز 50%، درجة EM
Osmium tetroxide	EMS	19190	محلول مائي بتركيز 4%
Uranyl acetate	EMS	22400	مسحوق
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	مسحوق
ورق ترشيح	Whatman	1450-090	size 50
مجهر إلكتروني نافذ	JEOL	JEM-1011	TEM