إعادة التشكيل والتنقية المختبرية للجسيمات الشبيهة بالقفيصة النووية الفيروسية

الملخص

المصدر: Gao, Y., et al. إنتاج وتجميع القفيصات النووية النوعية للفيروس في الفيروس المخلوي التنفسي. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح الفيديو عملية التجميع المختبري للقفيصات النووية الخاصة بالفيروس من معقد بروتين نووي-بروتين فسفوري منقى وخالٍ من RNA، وتنقيتها باستخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي، والتحقق من وجود RNA فيروسي كامل الطول داخل الجسيمات المجمعة.

البروتوكول

1. الاستنساخ الجزيئي

ملاحظة: استُخدم الاستنساخ المستقل عن الليغاز (LIC) لإنشاء بلازميد بناء للتعبير المشترك ثنائي السيسترون للفيروس المخلوي التنفسي (RSV). إن الاستنساخ المستقل عن الليغاز هو طريقة طُوّرت في أوائل التسعينيات، وتعتمد على نشاط الإنزيم خارجي النواة (Exo) من 3’ إلى 5’ لبوليميراز DNA T4 لإنشاء نهايات بارزة ذات تكامل بين الناقل وقطعة DNA المدرجة. وقد تم إنشاء البناءات باستخدام DNA الناقل 2BT-10، والذي يتكون من وسيم His ‏10x عند الطرف النتروجيني (N-terminal) لإطار القراءة المفتوح (ORF) (الشكل 1).

1. إجراء عملية خطية لنواقل LIC باستخدام هضم SSPI.
   1. اخلط 10 μL من منظم SSPI بتركيز 10X، و4 μL من إنزيم SSPI بتركيز 5 U/μL، والحجم المكافئ لـ 5 μg من DNA الناقل المستخلص بطريقة miniprep، وddH₂O معقم حتى يصل الحجم إلى 100 μL.
   2. حضن خليط الهضم لمدة 3 ساعات عند 37 °C.
   3. قم بتشغيل ناتج الهضم على هلام أغاروز بنسبة 1.0% لاستخلاص DNA الناقل.
   4. استخدم طقم استخلاص من الهلام لإجراء عملية الاستخلاص والتنقية. قم بإذابة الحجم النهائي من DNA الناقل في 30 μL من ddH₂O وخزنه عند -20 °C.

2. تحضير قطع DNA المدرجة لـ N1-391 وP1-126 باستخدام البادئ الأمامي N1-391، والبادئ العكسي N1-391، والبادئ الأمامي P1-126، والبادئ العكسي P1-126 (الجدول 1).

   ملاحظة: يوجد تداخل كافٍ مع الناقل الخطي لضمان درجة حرارة انصهار تتراوح بين 55 °C و60 °C. وبالنسبة للبادئ العكسي، يوجد تداخل كافٍ مع الشريط المكمل العكسي للناقل الخطي للسبب نفسه.

   الجدول 1. تسلسلات البادئات.

   البادئات	التسلسل
   N1-391 Forward	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3’
   N1-391 Reverse	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3'
   P1-126 Forward	5’-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3'
   P1-126 Reverse	5’-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3’

   1. إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لقطعة DNA المدرجة باستخدام الظروف المذكورة في الجدول 2 والجدول 3.
   2. استخلاص قطعة DNA المدرجة والمضخمة. قم بتشغيل نواتج PCR من الخطوة السابقة على هلام أغاروز بنسبة 1.0%، ثم استخلص الحزم ونقها عن طريق الاستخلاص من الهلام. أذب الحجم النهائي من DNA المستخلص في 15 μL من ddH₂O.

   الجدول 2. كواشف تضخيم PCR لقطعة DNA المدرجة.

   تضخيم PCR لقطعة DNA المدرجة
   15 μL	منظم تفاعل Pfu polymerase بتركيز 10x
   3 μL	البادئ الأمامي (بتركيز 100 μM)
   3 μL	البادئ العكسي (بتركيز 100 μM)
   15 μL	خليط ثلاثي فوسفات ديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) بتركيز 2.5 mM
   6 μL	DNA بلازميدي يحتوي على جين N أو P (100ng/ μL)
   7 μL	ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)
   3 μL	Pfu polymerase بتركيز 2.5U/μL
   الحجم للتكملة حتى 150 μL	ddH2O معقم

   الجدول 3. برنامج الدورات الحرارية لتضخيم PCR لقطعة DNA المدرجة.

   تضخيم PCR لقطعة DNA المدرجة
   الخطوة	الوقت	درجة الحرارة	الدورات
   المسخ	4 دقائق	95 ºC	1
   المسخ	45 ثانية	95 ºC	30
   الارتباط	30 ثانية	62 ºC
   التمديد*	90 ثانية	72 ºC
   التمديد	10 دقائق	72 ºC	1
   الحفظ	∞	4 ºC	1
   يمكن تشغيل الخليط الذي حجمه 150 μL في ثلاثة تفاعلات PCR منفصلة (3 × 50μL).
   *بالنسبة لـ Pfu DNA polymerase، فإن السرعة الموصى بها لمرحلة التمديد هي 1 kb/min. هنا، يكون طول كل من جين N1-391 أو جين P1-126 أقصر من 1.5 Kb. وبناءً على ذلك، تم استخدام 90 ثانية لخطوة التمديد.

3. معالجة الناقل وDNA المدرج بإنزيم T4 DNA polymerase (الجدول 4).

   الجدول 4. معالجة T4 DNA polymerase.

   معالجة T4 DNA polymerase
   منظم 10x	2 μL
   DNA الناقل/المدرج (0.1 pmol ناقل أو 0.2 pmol مدرج)	5 μL
   dNTP* بتركيز 25 mM	2 μL
   DTT بتركيز 100 mM	1 μL
   T4 DNA polymerase (مؤهل لـ LIC)	0.4 μL (1.25 U)
   ddH2O معقم	9.6 μL
   *استُخدم dGTP للناقل، واستُخدم dCTP لـ DNA المدرج.

   ملاحظة: يجب إجراء المعالجة بشكل منفصل لـ DNA الناقل وDNA المدرج.

   1. حضن الخليط لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم تعطيل البوليميراز حرارياً عند 75 °C لمدة 20 دقيقة. يُخزن خليط التفاعل عند -20 °C.
4. ارتباط ناقل LIC والناقل المدرج.
   1. إعداد ضابط سلبي باستخدام 2 μL من DNA ناقل LIC و2 μL من ddH₂O معقم.
   2. اخلط 2 μL من DNA المدرج و2 μL من DNA ناقل LIC من تفاعلات T4 DNA polymerase السابقة في أنبوب سعة 0.2 mL.
   3. إجراء تفاعل الارتباط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
   4. إيقاف التفاعل باستخدام 1.3 μL من حمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك (EDTA) بتركيز 25 mM.
   5. تحويل التفاعل إلى 100 μL من خلايا Escherichia coli Top10 المختصة وتوزيعها على طبق اختيار يحتوي على الأمبيسيلين.
5. تحديد البنى الإيجابية.
   1. تحضير محلول miniprep للبلازميد. يمكن القيام بذلك من خلال التقاط المستعمرات وتلقيحها في وسط مرق لوريا (LB). عادة ما تكون 3 مستعمرات كافية.
   2. حضن الخليط طوال الليل عند 37 °C.
   3. طرد مركزي للخليط عند 4,560 x g لمدة 10 دقائق والتخلص من السائل الطافي.
   4. إعادة تعليق الرواسب في 250 μL من منظم P1 وتحضير minipreps للبلازميد باستخدام طقم spin miniprep.
   5. إجراء تحليل هضم لمنتج miniprep باستخدام AseI أو إنزيمات قطع أخرى.
   6. تحميل العينات على هلام أغاروز بنسبة 0.8% وتشغيل البلازميد المهضوم. تحليل الهلام تحت مصباح UV.
   7. استخدام خدمة تسلسل للتحقق من تسلسل المنتج الإيجابي.

6. الحصول على قطعة DNA المدرجة للتعبير المشترك.

   1. إجراء PCR للحصول على N1-391 وP1-126 باستخدام 2BT-10 N1-391 و2BT-10 P1-126 التي تم بناؤها مسبقاً كقوالب.
   2. إجراء PCR الأول للحصول على N1-391 من بنية 2BT-10 N1-391 باستخدام ظروف PCR في الجدول 2 والجدول 3 مع البادئ الأمامي N1-391 والبادئ العكسي 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
   3. إجراء PCR الثاني للحصول على P1-126 من بنية 2BT-10 P1-126 باستخدام البادئ الأمامي: 5’-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGCAGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́ والبادئ العكسي P1-126 (استخدم ظروف PCR في الجدول 2 والجدول 3).
   4. أخيراً، إجراء overlap PCR على النواتج المختلطة من تفاعلي PCR السابقين لدمج N1-391 وP1-126. استخدم البادئ الأمامي N1-391 والبادئ العكسي P1-126. استخدم ظروف PCR في الجدول 5 والجدول 6.

   الجدول 5. كواشف overlap PCR.

   Overlap PCR
   15 μL	منظم تفاعل Pfu polymerase بتركيز 10X
   3 μL	البادئ الأمامي (100 μM)
   3 μL	البادئ العكسي (100 μM)
   15 μL	خليط dNTP (2.5 mM)
   3 μL	DNA من جولة PCR الأولى الذي يحتوي على جين N1-391 (100 ng/μL)
   3 μL	DNA من جولة PCR الأولى الذي يحتوي على جين P1-126 (100 ng/μL)
   7 μL	DMSO
   3 μL	Pfu polymerase (2.5 U/μL)
   الحجم للتكملة حتى 150 μL	ddH2O معقم

   الجدول 6. برنامج الدورات الحرارية لـ overlap PCR.

   Overlap PCR
   الخطوة	الوقت	درجة الحرارة	الدورات
   المسخ	4 دقائق	95 °C	1
   المسخ	45 ثانية	95 °C	30
   الارتباط	30 ثانية	62 °C
   التمديد*	دقيقتان	72 °C
   التمديد	10 دقائق	72 °C	1
   الحفظ	∞	4 °C	1
   يمكن تشغيل الخليط الذي حجمه 150 μL في ثلاثة تفاعلات PCR منفصلة (3 × 50 μL).
   *بالنسبة لـ Pfu DNA polymerase، فإن السرعة الموصى بها لمرحلة التمديد هي 1 kb/min. هنا، يكون الطول الإجمالي لجيني N1-391 وP1-126 أقصر من 2.0 Kb. وبناءً على ذلك، تم استخدام دقيقتين لخطوة التمديد.

7. ربط الناقل وقطعة DNA المدرجة.
   1. عالج ناتج overlap PCR بإنزيم T4 DNA polymerase باتباع البروتوكول المذكور في الخطوة 1.3.
   2. قم بإجراء ارتباط لناقل LIC وناتج PCR باتباع البروتوكول المذكور في الخطوة 1.4.
   3. حدد البنى الإيجابية باتباع البروتوكول المذكور في الخطوة 1.5.

2. التعبير عن البروتين وتنقيتها

ملاحظة: استخدم E. coli للبنية ثنائية السيزترون الخاصة بالتعبير المشترك لكل من N و P. قم باستزراع الخلايا عند 37 °C، ولكن أجرِ عملية التعبير عند درجة حرارة منخفضة (16 °C) طوال الليل. قم بتنقية المعقدات البروتينية من خلال مزيج من عمود الكوبالت، والتبادل الأيوني، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (الشكل 2).

1. استخدم سلالة E. coli BL21(DE3) لإنتاج البروتين. قم بزراعة 4 L من المزارع الخلوية عند 37 °C في وسط LB (Luria Broth) حتى تصل قيمة OD₆₀₀ إلى 0.6.
2. اخفض درجة الحرارة إلى 16 °C. بعد ساعة واحدة، حفز التعبير البروتيني باستخدام 0.5 mM من Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) طوال الليل.
3. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 4,104 x g لمدة 25 min ثم تخلص من السائل الطافي.
4. أعد تعليق كتل الخلايا في 200 mL من محلول التحلل المنظم A (50 mM sodium phosphate, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 10% glycerol, و 0.2% NP40). استخدم 50 mL من محلول التحلل لإعادة تعليق كتل الخلايا الناتجة من 1 L من المزرعة الخلوية.

5. قم بتحليل الخلايا باستخدام الموجات فوق الصوتية (sonication) لمدة 15 min، بنظام 3 ثوانٍ تشغيل و 3 ثوانٍ إيقاف. ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 37,888 x g لمدة 40 min.

   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً عن طريق تجميد الخلايا قبل عملية التحليل بالموجات فوق الصوتية في مجمد بدرجة حرارة -80 °C.

6. قم بتحميل السائل الطافي في عمود كوبالت بالجاذبية (القطر × الطول: 2.5 cm x 10 cm) يحتوي على ~10mL من الحبيبات التي تمت موازنتها مسبقاً باستخدام 5-10 أحجام عمود (CV) من محلول التحلل المنظم.
7. اغسل العمود باستخدام 5 CV من المحلول المنظم B (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 10% glycerol, و 5 mM imidazole) و 5 CV من المحلول المنظم C (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 10% glycerol, و 5 mM imidazole).
8. قم بشطف البروتين من الحبيبات باستخدام 2 CV من المحلول المنظم D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, و 250 mM imidazole).
9. خفف البروتين المشطوف بمقدار 5 أضعاف باستخدام المحلول المنظم QA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% Glycerol) من أجل عمود Q.
10. اغسل عمود Q سعة 5 mL بالمحلول المنظم QA لموازنة العمود، ثم حمل العينة المخففة في عمود Q باستخدام مضخة تمعجية (مثل Rabbit).
11. قم بتركيب عمود Q في جهاز HPLC جنباً إلى جنب مع المحلول المنظم QA والمحلول المنظم QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% glycerol). اضبط معدل التدفق عند 1 mL/min.
12. قم بتشغيل برنامج "غسل المضخة" (pump wash) لغسل الجهاز بالمحلول المنظم QB يليه المحلول المنظم QA (بمقدار 1-2 CV لكل منهما). اضبط تدفق النظام عند 3 mL/min.
13. اضبط UV1 على 280 nm و UV2 على 260 nm. استخدم طبقاً عميق الفجوات سعة 96 بئراً لجمع الأجزاء.
14. قم بشطف البروتينات باستخدام تدرج خطوي من عامل الشطف (المحلول المنظم QB) مع تطبيق 3-4 CV من كل تركيز، مع زيادة النسبة بمقدار 5% في كل مرة بدءاً من 0% QB. سيخرج معقد البروتين N0P عند 15% من المحلول المنظم QB.
15. بمجرد شطف جميع البروتينات، اغسل العمود باستخدام 100% من المحلول المنظم QB (بمقدار 2 CV).
16. اعزل البروتين عن طريق عمود الترشيح الهلامي Superdex 200 Increase 10/300 GL (القطر × الطول: 1.0 cm x 30 cm) ووازنه باستخدام المحلول المنظم E (20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid أو HEPES pH 7.4 و 200 mM NaCl).
17. حلل الأجزاء التي تحتوي على البروتين باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد بنزع الكبريتيد من الصوديوم (SDS-PAGE).

3. التجميع المختبري للـ NC النوعي للفيروس

ملاحظة: تم إجراء التجميع المختبري لـ NC الخاص بـ RSV (N:RNA) عن طريق تحضين معقد N0P المُجهز مع قليلات RNA. بعد ذلك، استُخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) لفصل معقد التجميع عن N0P وRNA الفائض (الشكل 2).

1. امزج معقد N0P المنقى مع RNA oligo بنسبة مولية 1:1.5 واحضنهما في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة؛ وعادة ما يكون 1 mL من البروتين N0P بتركيز 1 mg/mL كافياً للخطوة التالية. قم بتجهيز عينة ضابطة تحتوي فقط على نفس الكمية من بروتين N0P.
2. قم بموازنة عمود الترشيح الهلامي Superdex 200 Increase 10/300 GL مسبقاً باستخدام المنظم E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
3. قم بطرد العينة مركزياً عند 21,130 x g لمدة 15 min، وأزل أي رواسب ثم حمّل السائل الطافي على عمود SEC.
4. قارن صور كروماتوغرافيا SEC لعينة تجميع N:RNA وعينة N0P الضابطة، واجمع ذلك مع نسبة A260/A280 لتحديد أي القمم تمثل N-RNA المجمع، وN0P، وRNA الحر.
5. اجمع أجزاء القمة، ثم قم بإجراء هلام SDS-PAGE أو تحضير الشبكات.
6. بالنسبة لمعقد N-RNA المجمع، اجمع جميع أجزاء قمة N-RNA، وأجرِ استخلاص الـ RNA ثم قم بتشغيل هلام Urea-PAGE للتأكد من طول RNA المحدد، وهو نفس الذي تم مزجه وحضنه في الخطوة الأولى.

النتائج

الشكل 1. توضيح لتراكيب البلازميد. أ. تركيب RSV N1-391؛ ب. تركيب RSV P1-126؛ ج. التركيب ثنائي السيسترون للتعبير المشترك عن N1-391 وP1-126. تم تمييز الجين الأول RSV N1-391، والجين الثاني RSV P1-126، والجين المقاوم للمضادات الحيوية (AmpR)، والمحفزات في مربعات باللون الأصفر والسيان والوردي والبرتقالي على التوالي. وباختصار، تم بناء إدراجات جينات RSV N1-391 وRSV P1-126 بشكل منفصل ثم تجميعها.

الشكل 2. المخطط الانسيابي لتنقية المعقد البروتيني N1-391P1-126. يوضح المخطط عملية التلقيح والنمو واسع النطاق لمزارع خلايا E. coli وحصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. وبعد تحلل الخلايا، يتم تنقية عينات البروتين باستخدام كروماتوغرافيا الألفة (أي عمود Co2+)، وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني (أي عمود Q)، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم بالترشيح الهلامي (SEC). ثم تُحلل عينات البروتين بشكل إضافي باستخدام هلام SDS-PAGE.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Agarose	SIgma	A9539-500G	إنشاء التركيب باستخدام طريقة LIC
Ampicillin sodium	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	مضاد حيوي لمزرعة الخلايا
AseI	NEB	R0526S	إنشاء التركيب باستخدام طريقة LIC
Cobalt (High Density) Agarose Beads	Gold Bio	H-310-500	لتنقية بروتين His-tag
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	تسخين العينة
dCTP	Invitrogen	10217016	إنشاء التركيب باستخدام طريقة LIC
dGTP	Invitrogen	10218014	إنشاء التركيب باستخدام طريقة LIC
Glycerol	Sigma	G5516-4L	تحضير المحلول
HEPES	Sigma	H3375-100G	تحضير المحلول
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	تنقية البروتين
Imidazole	Sigma	I5513-100G	تحضير المحلول
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	تحفيز التعبير البروتيني
Microcentrifuge Tubes	VWR	47730-598	لتفاعل PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor	SpectraLab	MSX-XL-2020	جهاز سونيكاتور لتحليل الخلايا
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	هزاز لاستزراع الخلايا
Nonidet P 40 Substitute	Sigma	74385-1L	تحضير المحلول
OneTaq DNA Polymerase	NEB	M0480L	تفاعل PCR
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	تنقية DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	إنشاء التركيب باستخدام طريقة LIC
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	تنقية البروتين
T4 DNA polymerase	Sigma	70099-3	إنشاء التركيب باستخدام طريقة LIC
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	جهاز طرد مركزي، أعلى سرعة 20,000 rpm
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253-250G	تحضير المحلول