الكشف عن وسائط تضاعف الحمض النووي الريبوزي المزدوج (dsRNA) لفيروس زيكا باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الخلوية

الملخص

المصدر: كونتريراس، د.، وآخرون. نظام زراعة الخلايا المعدية لفيروس زيكا والتأثير الوقائي للإنترفيرونات في المختبر. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح الفيديو كيفية الكشف عن وسيطات dsRNA لفيروس زيكا في الخلايا الظهارية المصابة باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية. يتم تثبيت الخلايا المصابة ثم حجبها باستخدام محلول حجب. تضاف بعد ذلك الأجسام المضادة الأولية والثانوية. وتُصبغ النوى بصبغة فلورية. ثم يُفحص الـ dsRNA الفيروسي المسمى تحت مجهر فلوري.

البروتوكول

1. مقايسة تضاعف جينوم فيروس زيكا

1. قم بزراعة خلايا Vero الساذجة بكثافة 1 x 10⁵ خلية لكل بئر في أحجام قدرها 2 ml باستخدام طبق يحتوي على 12 بئراً. وفي اليوم التالي، قم بتحضير اللقاحات الفيروسية (بتعدد عدوى (MOI) يبلغ 0.01 و 0.1؛ 400 µl/بئر) بعيارات منخفضة وعالية باستخدام أوساط خالية من المصل في ثلاث مكررات. وبالنسبة للعدوى الوهمية، استخدم الأوساط الخالية من المصل (400 µl/بئر) فقط.
2. قم بحضن الطبق الملقح عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة 4-6 hr. وقم بتوزيع اللقاح عن طريق إمالة الطبق بلطف جانبياً كل ساعة واحدة.
3. في نهاية فترة الحضن، استبدل اللقاح بأوساط مضاف إليها المصل (2 ml لكل بئر).
4. عند النقاط الزمنية 48 و 96 hr، اجمع العينات لإجراء الكيمياء النسيجية المناعية الخلوية (ICC).
5. أجرِ الكيمياء النسيجية المناعية الخلوية (ICC) باستخدام الخلايا المثبتة بالميثانول.
   1. اغسل الخلايا المثبتة ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) بتركيز 1x، ثم قم بعملية الحجب باستخدام محلول حجب ICC (3% مصل ماعز، 3% ألبومين مصل بقري (BSA)، 0.1% Triton-x 100 في PBS).
   2. استخدم جسم مضاد أحادي النسيلة من الفأر ضد dsRNA J2 (بتركيز 1 µg/ml) بتخفيف 1:100 في محلول الحجب، واحضنه طوال الليل عند 4 °C.
   3. اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS وأضف جسماً مضاداً ثانوياً من الماعز ضد IgG-594 الفأري (بتركيز 1 µg/ml) بتخفيف 1:1,000 في محلول الحجب، واحضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
   4. اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS وقم بصبغ النوى باستخدام صبغة Hoechst، ثم افحص الخلايا باستخدام مجهر فلوري بقوة تكبير 100X (الشكل 1).

النتائج

الشكل 1: مقاييس لتقييم تضاعف فيروس زيكا (ZIKV). (A) يوضح الرسم البياني المحتوى الجينومي لفيروس زيكا الذي تم قياسه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المعتمد على النسخ العكسي (RT-qPCR). وأظهرت كل من بادئات جميع الأنماط الجينية (ZIKV GEN) وبادئات سلالة PRVABC59 (ZIKV UNI) حساسية وخصوصية متساويتين. وكما كان متوقعاً، لم تقم بادئات فيروس التهاب الكبد C (HCV) بتضخيم أي ناتج. (B) يمثل الرسم البياني حركية نمو فيروس زيكا في النقاط الزمنية المحددة في الخلايا المصابة بعيارات منخفضة وعالية مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المصابة (mock control). القيم المعطاة هي متوسط القيم والانحرافات المعيارية. (C) مقاييس الكيمياء النسيجية المناعية لتقصي التضاعف الفيروسي. حيث صُبغت الخلايا المصابة بفيروس زيكا بشكل محدد باستخدام أجسام مضادة لـ dsRNA. عند 48 hpi، تظهر الخلايا المصابة في بضعة تجمعات، بينما عند 96 hpi، تكون معظم الخلايا مصابة. استُخدم صبغ Hoechst لتصوير النوى (شريط القياس = 50 µm). BF: صورة بالمجال المضيء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وسط Dulbecco المعدل Eagle (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
جسم مضاد أحادي النسيلة من الفأر مضاد لـ dsRNA J2	الإنجليزية & Scientific Consulting Kft.	10010200
جسم مضاد من الماعز مضاد لـ IgG الأرنب Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
سلالة خلايا Vero	ATCC	CCL-81
سلالة فيروس زيكا PRVABC59	مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC)
مجهر Nikon Eclipse Ti للتألق المناعي مع Nikon Intenselight C-HGFI	Nikon	تفضل بزيارة Nikon لتقديم الطلب