تركيز وتنقية الجسيمات الفيروسية

الملخص

المصدر: Fricano-Kugler, C. J., et al. تصميم وتعبئة وتوصيل فيروسات CRISPR الارتجاعية والبطيئة عالية العيار عبر الحقن بالتوجيه المجسم. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو العملية الخطوية لتركيز وتنقية الجسيمات الفيروسية البطيئة (lentiviral particles) من معلق مختلط يحتوي على بقايا الخلايا المضيفة. تعتمد هذه الإجراءات على الطرد المركزي، والترشيح، والترسيب باستخدام ملح PEG لعزل الجسيمات الفيروسية مع إزالة الشوائب الذائبة. يتم بعد ذلك إعادة تعليق المنتج النهائي في محلول منظم وتخزينه في درجات حرارة منخفضة للغاية للحفاظ على القدرة المعدية للفيروس وسلامته الهيكلية.

البروتوكول

1. تركيز الفيروس وتنقيته

1. قم بتحضير محلول 5x polyethylene glycol 6000 عن طريق إضافة 40% polyethylene glycol 6000 و 1.5 M NaCl إلى ddH₂O. عقم المحلول باستخدام الموصدة (Autoclave) في دورة السوائل لمدة 45 min عند 121 °C. اخلط المحلول ببطء أثناء التبريد.
   ملاحظة: سيكون المحلول عكراً في البداية ثم يصبح صافياً عندما يبرد.
2. قم بطرد مركزي للأنبوب المخروطي سعة 50 ml الذي يحتوي على مجموعتي السائل الطافي الفيروسي عند 2,000 x g لمدة 10 min لترسيب المواد غير القابلة للذوبان. نَقِّ الوسط الفيروسي عن طريق الترشيح باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.45 µm ومنخفض الارتباط بالبروتين (PES أو PVDF).
3. أضف محلول 5x polyethylene glycol 6000 إلى الوسط (يجب أن يكون التركيز النهائي 8% polyethylene glycol 6000 و 0.3 M NaCl). اخلط عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات (تجنب استخدام جهاز الرج vortex). حضّن محلول polyethylene glycol المحتوي على الفيروس عند 4 °C لمدة 12 hr أو أكثر، مع إعادة الخلط من حين لآخر.
4. (اليوم 9) قم بطرد مركزي لمحلول polyethylene glycol المحتوي على الفيروس عند 2,500 x g لمدة 45 min. أزل السائل الطافي وتخلص منه، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 2 min. أزل السائل الطافي وتخلص منه مجدداً.
5. أعد تعليق الراسب بإضافة 320 µl من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) المعقم (تمثل 320 µl جزءاً واحداً من 100 من الحجم الأصلي للوسط المحتوي على الفيروس الذي تم جمعه) وحضّنه طوال الليل عند 4 °C. اختيارياً، يمكن إعادة تعليق الراسب في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز (rocker) لمدة 30 min.
6. بعد إعادة تعليق الراسب، قسم الفيروس إلى حصص (5-10 µl لكل أنبوب سعة 0.5 ml) وجمد الحصص عند -80 °C (سيؤدي التجميد والإذابة أو التخزين عند 4 °C إلى خفض العيار الفيروسي بشكل كبير).
7. حدد عيار الفيروسات باستخدام البروتوكولات القياسية، أي عن طريق إجراء سلسلة تخفيفات على طبق 6-well من خلايا HEK293T وعد المستعمرات الفلورية يدوياً بعد 48 hr.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
قائمة كواشف تعداء الخلية
أنابيب بولي ستيرين سعة 5 مل	Fisher Scientific	352054
بولي إيثيلين جليكول 6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) بتركيز (10x)	التشخيصات الوطنية	CL-253
أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 0.5 مل	USA Scientific	1605-0000
ماتريجيل (Matrigel)	Fisher Scientific	CB-40230A