تقييم نظام تغطية سائل لمقايسات اللويحات الفيروسية

الملخص

المصدر: Baer, A. and Kehn-Hall, K. تحديد التركيز الفيروسي من خلال مقايسات اللويحات: استخدام أنظمة التغطية التقليدية والمبتكرة. J. Vis. Exp. (2014).

يوضح هذا الفيديو استخدام طبقة تغطية سائلة قائمة على السليلوز الجريئي في مقايسة تعتمد على اللويحات، وذلك من خلال مقارنة فعاليتها في تكوين اللويحات الفيروسية مع طبقة تغطية تقليدية من الآجار شبه الصلب.

البروتوكول

1. تحضير الخلايا والكواشف

1. في اليوم السابق للمقايسة، قم بزراعة الخلايا المضيفة المناسبة للفيروس المعني فيجدول 1 و جدول ٢) عند وصول درجة الالتحام إلى 90-100%.
2. قم بتحضير محلول تثبيت يتكون من فورمالديهايد بنسبة 10% في H₂هـ. على سبيل المثال، اخلط 5.56 مل من محلول الفورمالديهايد المخزون بتركيز 36% مع 14.44 مل من الماء المقطر H2O₂ماء مقطر (dH2O)₂و).
   ملاحظة: استخدم ممارسات التداول الآمن والتهوية المناسبة عند استخدام الفورمالديهايد.
3. تحضير صبغة البنفسج البلوري: 1% بنفسج بلوري (CV) في 20% إيثانول وماء مقطر (dH2O)₂أ.
4. قم بتحضير وسط تكوين اللويحات بتركيز 2x (يكون بتركيز 2x وفقاً لنوع الخلايا؛ انظر جدول 2). يتم الترشيح باستخدام 0.2 µm قم بالترشيح في حال عدم تعقيم أي من الكواشف.
5. تحضير طبقات التثبيت الغطائية (جدول 3)
   1. بالنسبة للأغطية السائلة، قم بتحضير محلول معقم من Avicel بتركيز 2.4% في الماء المقطر (dH2O).₂هـ. لمنع التكتل، أضف المسحوق إلى دورق يحتوي على ماء يتم خلطه بسرعة بواسطة قضيب تحريك مغناطيسي؛ صب Avicel ببطء وحرّكه بسرعة في درجة حرارة الغرفة (RT). وعندما يصبح المحلول شديد اللزوجة بحيث لا يستطيع قضيب التحريك جعله متجانساً، انتقل إلى استخدام هزاز الدوارق لـ >لمدة 30 دقيقة مع التقليب الشديد لضمان التجانس التام.
      ملاحظة: يمكن تحضير المحاليل المخزنة بتركيزات أقل، ولكن قد تنفصل هذه المحاليل، مما يتطلب إعادة خلطها لضمان التجانس. ويمكن استخدام محاليل عمل من Avicel بتركيزات تتراوح بين 0.6 و3%.
   2. بعد التجانس، قم بتعقيم المحلول باستخدام الموصدة (autoclave) واحفظه مغلقاً في درجة حرارة الغرفة.
   3. بالنسبة لطبقات التغطية المكونة من الأجاروز والكربوكسي ميثيل السليلوز (CMC)، قم بتحضير محلول مخزني في الماء المقطر (dH2O)₂من 2% CMC أو 0.6% agarose. اخلط المزيج باستخدام قضيب تحريك، ثم استخدم الموصدة (autoclave) أو الميكروويف لإذابته وتحويله إلى محلول.

2. التخفيفات والعدوى

1. في اليوم التالي لعملية الزراعة، افحص بصرياً مدى تلاحم الخلايا وحيويتها قبل البدء في المقايسة. تأكد من أن المورفولوجيا الخلوية طبيعية وجود طبقة أحادية متلاحمة بنسبة ~90%.
2. قم بإجراء تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف للعينات المعدية. استخدم أوساط النمو الخلوية المخصصة للتكاثر الفيروسي كمحلول مخفف (Table 2). قم بتغيير عدد التخفيفات المطلوبة بناءً على العيار المتوقع للفيروس المعني، واستخدم دائماً عينة ضابطة غير مصابة لضمان الحيوية الخلوية بشكل مستقل والمساعدة في تحديد اللويحات.
3. من التخفيفات التسلسلية، قم بإصابة الخلايا لمدة تتراوح من 45 min إلى 1 hr (Table 1). استخدم حجماً كافياً من اللقاح لتغطية الخلايا، مع الحفاظ على الحجم أقل ما يمكن لزيادة التلامس الفيروسي مع الطبقة الأحادية إلى أقصى حد (Table 4). قم بهز الأطباق برفق كل 20 min لضمان التغطية المتساوية ومنع جفاف الطبقة الخلوية الأحادية.
4. بعد الإصابة، أضف حجماً مناسباً من وسط التثبيت مباشرة فوق اللقاحات في البئر (Table 2) باستخدام خليط بنسبة 1:1 من أوساط اللويحات 2x وطبقة التثبيت المختارة (CMC أو agarose أو Avicel). هز برفق للمزج.
   1. بالنسبة للطبقات السائلة، امزج بنسبة 1:1 بين أوساط لويحات 2x دافئة ومحلول Avicel مخزن بتركيز 1.2 - 2.4% في درجة حرارة الغرفة للحصول على محلول عمل من وسط تغطية Avicel بتركيز 0.6-1.2%.
   2. بالنسبة لطبقة agarose، استخدم خليطاً بنسبة 1:1 من أوساط لويحات 2x دافئة ومحلول مخزن من agarose مسخن بتركيز 0.6%، وضعه في حمام مائي بدرجة حرارة 56 °C لمدة 30 min لمعادلة درجة الحرارة والحصول على تركيز نهائي من agarose/overlay بنسبة 0.3%.
   3. بالنسبة لـ CMC، قم بتحضير محلول مخزن بتركيز 2% وتعامل معه كما هو موضح في طبقة agarose.
   4. عند تطبيق طبقة التغطية على الطبقة الأحادية، قم دائماً بمعادلة agarose أو CMC الساخن في ماء بدرجة حرارة 56 °C لمنع تلف الطبقة الأحادية. تأكد من أن المحلول دافئ، ولكن ليس ساخناً عند اللمس لمنع موت الخلايا وانخفاض العيارات الفيروسية. تبدأ معظم طبقات agarose في التصلب تحت درجة حرارة 42 °C، لذا اعمل بسرعة و/أو قم بتحضير دفعات صغيرة لمنع التصلب أثناء المناولة.
5. بعد إضافة طبقة التغطية، قم بحضن الأطباق لإنتاج لويحات متميزة يمكن عدها بوضوح. قد يستغرق تكوين اللويحات من 2–14 days اعتماداً على الفيروس الذي يتم تحليله (Table 1).
   ملاحظة: بمجرد وضع الأطباق ذات التغطية السائلة في الحاضنة، لا تحركها. حيث إن تحريك الطبقات السائلة خلال فترة الحضن سيؤدي إلى تلطخ اللويحات. أما طبقات agarose وCMC فهي شبه صلبة ويمكن تحريكها أو فحصها دورياً تحت المجهر الضوئي لمراقبة تطور اللويحات.

3. تثبيت الخلايا وصبغها

1. لتثبيت الخلايا، قم بسكب أو شفط غطاء Avicel، ثم ثبت الخلايا باستخدام محلول فورمالديهايد بتركيز 10% لمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى ليلة كاملة (<1 ml لكل بئر في طبق ذو 6 آبار).
   1. في حالة استخدام الأجاروز أو CMC، أضف محلول الفورمالديهايد مباشرة إلى الغطاء لمدة ساعة واحدة أو ليلة كاملة.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالعينات لفترات طويلة في المثبت شريطة ألا يتبخر أو يجف، لأن ذلك قد يؤدي إلى تشويه الطبقة الأحادية.
2. قبل التلوين وبعد التثبيت، تخلص من الفورمالديهايد وأزل السدادات شبه الصلبة للأجاروز وCMC إما باستخدام الماء الجاري أو يدويًا باستخدام ملعقة مسطحة (spatula). اشطف لويحات Avicel بالماء لإزالة بقايا الغطاء/المثبت قبل التلوين.
3. للتلوين، غطِّ الخلايا بأقل كمية ممكنة من محلول الكريستال البنفسجي (crystal violet) لمدة 15 دقيقة تقريبًا. قم بهز الأطباق إذا لزم الأمر لضمان التغطية المتساوية.
4. اغسل صبغة الكريستال البنفسجي بلطف باستخدام الماء. وبمجرد تثبيت اللويحات وتلوينها وتجفيفها، يمكن تخزينها لفترة غير محدودة من أجل التحليلات المستقبلية.

الجدول 1. ظروف تلقيح مقايسة اللويحات وأنواع الخلايا

	RVFV	VEEV	Influenza B
نوع الخلية	Vero	Vero	MDCK
فترة العدوى	1 hr	1 hr	45 min
وقت الحضانة	3 days	2 days	3 days

 

الجدول 2. أوساط نمو اللويحات والنمو الفيروسي/الخلوي

	RVFV	VEEV	Influenza B
نوع الخلية	Vero	Vero	MDCK
نوع النمو	DMEM1	DMEM1	DMEM2
وسط تكوين اللويحات	2xEMEMA	2xEMEMA	2xEMEMB

1. وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium مضاف إليه 10% من مصل جنين العجل (Fetal Bovine Serum)، و1% L-Glutamine، و1% Penicillin/Streptomycin.

2. وسط دولبيكو المعدل إيجل (Dulbecco's Modified Eagle Medium) مضاف إليه 1% L-Glutamine، و1% بنسيلين/ستربتوميسين، و0.2% ألبومين المصل البقري، و0.025% HEPES، وDEAE-Dextran بتركيز 50 ميكروغرام/مل.

أ. وسط غذائي أساسي أدنى (Minimal Essential Media) بتركيز 2x (كمية 500 ml) مدعم بـ 5% FBS (كمية 25 ml)، و1% أحماض أمينية أساسية دنيا (كمية 5 ml)، و1% بيروفات الصوديوم (كمية 5 ml)، و1% L-Glutamine (كمية 5 ml)، و2% Pen/Strep (كمية 10 ml).

ب. وسط أساسي أدنى بتركيز 2x (500 ml) مضاف إليه 0.2% Bovine Serum Albumin، و1% من الأحماض الأمينية الأساسية الدنيا (5 ml)، و50ug/ml، و0.025% HEPES، وDEAE-Dextran، وTrypsin-TPCK*

*قبيل التحضير مباشرةً، أضف 1 µl لكل 25 ml من محلول TPCK-Trypsin المخزون بتركيز 2 µg/ml إلى الجزء الذي ستستخدمه للمزج مع الآغاروز لتكوين اللويحات.

الجدول 3. مخزون الطبقات الغطائية

	RVFV	VEEV	Influenza B
نوع الخلية	Vero	Vero	MDCK
فترة العدوى	1 hr	1 hr	45 min
مدة الحضانة	3 days	2 days	3 days

 

الجدول 4. تنسيقات الأطباق

	6 آبار	12 بئرًا	96 بئرًا
عدد الخلايا/البئر	5 x 105	2.5 x 105	3 x 104
حجم اللقاح (μl)	400	200	50
حجم الطبقة الغطائية (ml)	3	1.5	0.100

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
البنفسج البلوري	Sigma Aldrich	C3886-25G
محلول الفورمالديهايد	Sigma Aldritch	F8775-500مل
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	رُج جيداً عند إعادة التحضير لـ >30 دقيقة للتجانس
أجاروز فائق النقاء (UltraPure agarose)	Invitrogen	16500-100
كربوكسي ميثيل السليلوز، ملح الصوديوم، لزوجة متوسطة	Sigma Aldrich	C4888