وتتميز التنمية في وقت مبكر من ذبابة الفاكهة ، وذبابة الفاكهة السوداء البطن ، من قبل عدد من التغييرات شكل الخلية التي هي مناسبة تماما للنهج التصوير. هذه المادة سوف تصف الأدوات الأساسية والأساليب اللازمة لتصوير الأجنة الحية مبائر ذبابة الفاكهة ، وستركز على تغيير شكل خلية تسمى cellularization.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البلدان النامية الجنين melanogaster ذبابة الفاكهة يخضع لعدد من التغييرات شكل الخلية التي هي قابلة للعيش عالية مبائر التصوير. يتغير شكل خلية في الذبابة هي مشابهة لتلك الموجودة في أعلى الكائنات الحية ، وأنهم يؤدون التشكل الأنسجة. بذلك ، في كثير من الحالات ، دراستهم له تداعيات مباشرة لفهم الأمراض التي تصيب البشر (الجدول 1) 1-5. على النطاق الفرعي الخلوية ، وهذه التغييرات شكل الخلية هي نتاج الأنشطة التي تتراوح بين التعبير الجيني لنقل الإشارة ، قطبية الخلية ، وإعادة تشكيل هيكل الخلية والاتجار الغشاء. وبالتالي ، فإن الجنين ذبابة الفاكهة يوفر ليس فقط في سياق تقييم يتغير شكل الخلية من حيث صلتها التشكل الأنسجة ، ولكن كما يوفر بيئة الفسيولوجية تماما لدراسة الأنشطة الفرعية الخلوية أن الخلايا الشكل.
وصف بروتوكول يهدف الى هنا صورة شكل خلية معينة تسمى cellularization تغيير. Cellularization هو عملية دراماتيكية غشاء البلازما النمو ، ويحول في نهاية المطاف إلى الجنين المخلوي الأريمة الخلوية. وهذا هو ، في الطور البيني من دورة الإنقسامية 14 ، غشاء البلازما invaginates في وقت واحد حول كل من نوى 6000 ~ رست cortically لتوليد ورقة من الخلايا الظهارية الابتدائي. العداد إلى الاقتراحات السابقة ، ليست مدفوعة من قبل الميوسين cellularization انقباض - 2 6 ، ولكن بدلا من ذلك إلى حد كبير وتتغذى بواسطة إيماس من الغشاء الداخلي من مخازن 7. وهكذا ، cellularization هو نظام ممتاز لدراسة الاتجار غشاء الخلية خلال التغييرات التي تتطلب شكل البلازما انغلاف الغشاء أو التوسع ، مثل الحرائك الخلوية أو عرضية - نبيب (T - نبيب) التشكل في العضلات.
علما بأن يتم تطبيق هذا البروتوكول بسهولة إلى التصوير من تغييرات أخرى في شكل خلية الجنين يطير ، ويتطلب تعديلات طفيفة فقط مثل تغيير مرحلة جمع الجنين ، أو باستخدام "الغراء الجنين" لتحميل الجنين في اتجاه معين (الجدول 1) 19/08. في جميع الحالات ، وسير العمل في الأساس نفسه (الشكل 1). وتستخدم الأساليب الموحدة لاستنساخ وtransgenesis ذبابة الفاكهة لإعداد مخزونات يطير المستقرة التي تعبر عن البروتين من الفائدة ، وتنصهر لبروتين الفلورية الخضراء (GFP) أو مشتقاته ، وهذه الذباب توفير مصدر متجدد للأجنة. بدلا من ذلك ، يتم تقديمها مباشرة البروتينات الفلورية / تحقيقات في الأجنة تطير مباشرة عبر الحقن التقنيات المتناهية الصغر 9-10. ثم ، اعتمادا على الحدث التنموية وتغيير شكل خلية ليمكن تصوير ، يتم جمع الأجنة والتي قام بها التشكل على مجهر تشريح ، والمتمركزة في النهاية ومنصة لمرور الزمن على التصوير مبائر المجهر.
البروتوكول
1. تجميع الكؤوس جمع الأجنة
- قطع الجزء السفلي الخروج من الكأس ثلاثي الذرة 100 مل بشفرة الحلاقة ، مما يجعل من حافة بأكبر قدر من السلاسة. الكؤوس هي أسهل للتعامل مع تقليم إذا كنت أيضا الزوايا الثلاث الخروج من القمة ، رغم أن هذا ليس ضروريا على الاطلاق.
- قطع مربعة من اسلاك (6 سم × 6 سم). على طبق من قبل حرارة ساخنة ، داخل طبقة الدخان ، غطاء مربع شبكة سلكية على رأس قطعة من رقائق الألومنيوم الثقيلة. دفع خفض الحافة السفلى من كأس بشدة كي تستقر على شبكة الساخنة. انتظر بضع ثوان ، ورفع الكأس مع شبكة تعلق ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصف بروتوكول هنا سوف تسمح للعيش ، والتصوير مبائر عدد من التغييرات شكل خلية في جنين ذبابة النامية. يمكن أن تكون على استعداد لتصوير GFP الأسهم من قبل مختبر الفردية (الجدول 2) ، ولكن العديد من هذه الأسهم هي أيضا متاحة للجمهور من مراكز مثل مركز ألبوم بلومينغتون ذبابة الفاكهة في جامعة إنديانا ( http://flystocks.bio.indiana.edu ) وصائدة الذباب مركز الأسهم في جامعة ييل ( http://flytrap.med.yale........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نحن نعترف بامتنان اريك Wieschaus ، الذين قدموا الأساس الذي وضعت هذا البروتوكول. ويدعم عملنا في وزارة ماكلين فيرنا Marrs والكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية البدء الجائزة ، كلية بايلور للطب.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شرائح | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| أغطية شرائح 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| زجاجات الرش (H2أ) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| أنابيب فالكون سعة 50 مل | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| بصيلات للمصات الصغيرة، 1 مللتر | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| قوارير وميضية مع أغطيتها | VWR international | 66021-533 | |
| دوارق ثلاثية الزوايا، 100 مل | علوم المجهر الإلكتروني | 60970 | |
| طبق بتري BD Falcon مقاس 60×15 مم | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| مصفاة خلايا BD Falcon | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| رؤوس ماصات صفراء | Rainin | L200 | |
| شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ، 304، 12x24 | شركة Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| زجاج 5¾ ماصات باستير قياس 1 بوصة | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| ورق ترشيح P4 | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| أربطة مطاطية | Office Max | A620645 | |
| شريط Scotch اللاصق مزدوج الوجه، ½ بوصة | أوفيس ماكس (Office Max) | A8137DM-2 | |
| فرش رسم Robert Simmons Expression من نوع E85 مستديرة مقاس 2 | جيري’أرتاراما (Artarama) | 56460 | |
| ملقط Dumont #5 عالي الدقة من الفولاذ المقاوم للصدأ (Inox) | علوم المجهر الإلكتروني | 72701-DZ | |
| شفرات الحلاقة | VWR international | 55411-050 | |
| زيت الهالوكربون 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| هيبتان | Fisher Scientific | H360-1 | |
| آجار بكتو من BD | VWR international | 90000-760 | |
| السكروز | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| حمض ب-هيدروكسي بنزويك | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| خميرة Red Star الجافة النشطة | LeSaffre | 15700 | |
| مناشف ورقية، طي على شكل حرف C | Kleenex | ||
| ورق ألومنيوم شديد التحمل | ورق القصدير من ماركة Reynolds Wrap | ||
| مبيض | أوستن’تجارية A-1 | ||
| عصير تفاح 100% | أوشن سبراي أو تري توب |
المراجع
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., G....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
