تثبيت العينة كاملة في الموضع استُخدم التهجين الموضعي في الموقف الكامل (WISH) في مقرر أحياء الفقاريات المقارنة لطلاب المرحلة الجامعية المتقدمة، بالإضافة إلى عمليات تشريح الفقاريات. وقد أتاح ذلك للطلاب فرصة دراسة أنماط التعبير الجيني إلى جانب التشريح العياني، مما ربط بين دراسة البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الكائنات الحية ضمن مقرر دراسي واحد.
مقالة منهجية
جبل به الجامعة في الموقع تهجين ارتباط البيولوجيا الجزيئية والعضوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يُعد التهجين الموضعي في العينات الكاملة (Whole mount in situ hybridization (WISH)) تقنية شائعة في مختبرات البيولوجيا الجزيئية تُستخدم لدراسة التعبير الجيني من خلال تحديد موقع نسخ mRNA محددة داخل عينة كاملة. تم استخدام هذه التقنية (المقتبسة من Albertson and Yelick, 2005) في فصل دراسي لمختبر بيولوجيا الفقاريات المقارنة لطلاب المرحلة الجامعية المتقدمة في جامعة Syracuse. أتاح الثلثان الأولان من مساق مختبر بيولوجيا الفقاريات المقارنة للطلاب فرصة دراسة علم الأجنة والتشريح العياني لعدة كائنات تمثل مجموعات تصنيفية مختلفة من الحبليات، وذلك بشكل أساسي عبر عمليات التشريح التقليدية واستخدام النماذج. وتضمن الجزء الأخير من المساق نهجاً مبتكراً لتدريس التشريح من خلال ملاحظة تطور الفقاريات باستخدام تقنيات جزيئية، حيث أُجريت تقنية WISH على أجنة أسماك الزيبرفيش (zebrafish). تم استخدام سلالة طافرة متغايرة الزيجوت لعامل نمو الأرومة الليفية 8 أ (fgf8a) تُسمى ace. وبسبب الوراثة المندلية، أنتجت التزاوجات الداخلية لـ ace أنواعاً برية، ومتغايرة الزيجوت، وطفرات ace/fgf8a متماثلة الزيجوت بنسبة 1:2:1. استُخدمت مسابر RNA ذات أنماط تعبير معروفة في الخط المتوسط وفي الهياكل التشريحية النامية مثل القلب، والجسيدات (somites)، وبرعم الذيل، والقطعة العضلية (myotome)، والدماغ. أُجريت تقنية WISH باستخدام أسماك الزيبرفيش في مرحلتي 13 somite و prim-6، حيث قام الطلاب بإجراء تفاعل التلوين داخل الفصل. ومنح دراسة أجنة الزيبرفيش في مراحل تطورية مختلفة الطلاب القدرة على ملاحظة كيفية تغير هذه الهياكل التشريحية عبر التطور الفردي (ontogeny). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت بعض طفرات ace/fgf8a التواءً غير سليم في القلب، وعيوباً في تطور الجسيدات والدماغ. لاحظ الطلاب في هذا المختبر التطور الطبيعي لمختلف أجهزة الأعضاء باستخدام كل من التشريح الخارجي وأنماط التعبير الجيني. كما قاموا بتحديد ووصف الأجنة التي أظهرت تطوراً تشريحياً وتعبيراً جينياً غير سليم (أي الطفرات المفترضة).
بالنسبة للمحاضرين في المؤسسات التي لا تمتلك بالفعل المعدات اللازمة أو حيث تكون التمويلات المخصصة للابتكار في المختبرات والمناهج الدراسية محدودة، قد تكون التكلفة المالية للكواشف والأجهزة عاملاً يجب مراعاته، وكذلك الوقت والجهد المطلوبين من جانب المحاضر بغض النظر عن البيئة التعليمية. ومع ذلك، فإننا نرى أن استخدام تقنية WISH في هذا النوع من المختبرات الصفية يمكن أن يوفر رابطاً مهماً بين علم الوراثة التنموي وعلم التشريح. ومع تقدم التكنولوجيا وأصبحت القدرة على دراسة تطور الكائنات الحية على المستوى الجزيئي أسهل وأرخص وأكثر شيوعاً، يتجه العديد من علماء الأحياء التطورية وعلم البيئة وعلماء الفسيولوجيا إلى استراتيجيات البحث في مجال البيولوجيا الجزيئية. ويعد استخدام WISH في مختبر مادة بيولوجيا الفقاريات المقارنة مثالاً على كيفية التقاء الجزيئات والتشريح ضمن مساق دراسي واحد. وهذا يمنح طلاب المستويات الجامعية العليا الفرصة لممارسة تقنيات البحث البيولوجي الحديثة، مما يؤدي إلى تعليم أكثر تنوعاً وتعزيز البحوث العلمية المستقبلية متعددة التخصصات.
البروتوكول
1. البلازميد تحول الهدف [كدنا]
الجزء الأول : التحول من البلازميد
(الوقت المطلوب : 3 ساعات بالإضافة إلى حضانة بين عشية وضحاها)
- SOC المرق الحار المغذيات في حمام المياه رقم 42 C (500 ميكرولتر في رد فعل)
- ذوبان الجليد على الخلايا المختصة
- إضافة 1 ميكرولتر البلازميد على الخلايا المختصة 25 ميكرولتر
- مكان على الجليد لمدة 20 دقيقة
- خلايا الصدمة الحرارية في درجة حرارة 42 درجة مئوية حمام ماء لمدة 45 ثانية
- المكان على الفور الخلايا على الجليد لمدة 2 دقيقة
- إضافة 500 ميكرولتر من 42 درجة مئوية مرق المغذيات إلى كل قارورة من الخلايا
- هزة بلغت 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في 255 التناوب في الدقيقة الواحدة (دورة في الدقيقة)
- 75 لوحة مزيج التحول ميكرولتر Bertani على لوحات لوريا آجار (LB)
- لوحات احتضان مقلوب على 37 درجة مئوية خلال الليل
الجزء الثاني : E. القولونية الثقافة
(الوقت المطلوب : 15 دقيقة بالاضافة الى حضانة بين عشية وضحاها)
- لكل رد الفعل ، قسامة LB مل مرق 3 و 3 ميكرولتر من الأمبيسيلين ملغ / مل 50 في أنبوب الثقافة
- كشط 1 مستعمرة البكتيريا من لوحة آغار وإضافة إلى كل أنبوب الثقافة
- هزة أنابيب الثقافة في 37 في 255 دورة في الدقيقة درجة مئوية خلال الليل
الجزء الثالث : الإعدادية البلازميد
(الوقت المطلوب : 1.5 ساعة)
- عزل البلازميد من الثقافات بين عشية وضحاها باستخدام 5 رئيس مجموعة صغيرة FastPlasmid (كتالوج # 2300000)
- للتحقق من وجود البلازميد أعد تشغيل eluted الحمض النووي من عدة على هلام 1 ٪ تريس - خلات - EDTA (تاي) ملطخة بروميد إيثيديوم
2. DIG في الموقع المسمى التجميعي دقق RNA
الجزء الأول : الخطية من البلازميد
(الوقت المطلوب : 2.5 ساعة)
- في أنبوب 1.5 مل microfuge ، والجمع :
أعد البلازميد 20 مل * تقييد أنزيم 2 مل ** العازلة 10 مل 10X الزلال المصل البقري (BSA) 10 مل إثيل Pyrocarbonate (DEPC) المياه 58 مل 100 مل - احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة
* يختلف مع البلازميد
** يختلف مع انزيم التقييد
الجزء الثاني : النسخ
(الوقت المطلوب : 3 ساعات)
- في أنبوب 1.5 مل microfuge ، والجمع :
الخطي البلازميد 4 مل 10X النسخ الاحتياطي ** 4 مل Digoxigenin تسمية ميكس 4 مل * بوليميريز 2 مل ريبونوكلياز المانع 2 مل DEPC المياه 24 مل 40 مل - في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة
- إضافة 2 ميكرولتر من بوليميريز *
- في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة
- إضافة 2 ميكرولتر من الدناز
- احتضان في 37 لمدة 20 دقيقة درجة مئوية
* يختلف مع البلازميد
** يختلف مع بوليميريز
الجزء الثالث : الأمطار
(الوقت المطلوب : 5 دقائق زائد ساعة 2 إلى الحضانة بين عشية وضحاها ، 1 ساعة لأجهزة الطرد المركزي وإعادة تعليق)
- إضافة 4 ميكرولتر من EDTA 0.2M
- إضافة 5 ميكرولتر من كلوريد الليثيوم 4M
- إضافة 150 ميليلتر من الإيثانول الباردة الجليد 100 ٪
- في احتضان -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ليلة وضحاها
- الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية ، بعيدا صب طاف
- بيليه جافة لمدة 7 دقائق
- في 20 ميكرولتر المياه DEPC إعادة تعليق ،
- احتضان في 37 لمدة 5 دقائق درجة مئوية
الجزء الرابع : التقطير -- إجراء التحقيق إلا إذا كان حجم أكبر من 0.6 كيلو بايت
(الوقت المطلوب : يختلف بناء على حجم التحقيق ، لا عادة أكثر من 20 دقيقة)
- في أنبوب 1.5 مل microfuge ، والجمع :
دقق RNA 20 مل DEPC المياه 12 مل بيكربونات الصوديوم 4 مل كربونات الصوديوم 4 مل 40 مل - احتضان في حمام الماء 60 ° C. قاعدة فترة حضانة على المعادلة التالية :
الوقت (مقدار) = (بدءا كيلوبايت -- المطلوب كيلوبايت) / (0.11 س س المطلوب بدءا كيلو بايت)
متوسط الحجم المطلوب = 0.6 كيلوبايت
الجزء الخامس : الأمطار النهائي
(الوقت المطلوب : 5 دقائقutes زائد ساعة 2 إلى الحضانة بين عشية وضحاها ، 1 ساعة لأجهزة الطرد المركزي واعادة تعليق ، 1 ساعة الكهربائي للهلام)
- إضافة الماء DEPC 40 ميكرولتر
- إضافة خلات الصوديوم 8 ميكرولتر
- إضافة 1.04 ميكرولتر الجليدية حمض الخليك
- إضافة 240 الجليد الباردة ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪
- في احتضان -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ليلة وضحاها
- الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية ، بعيدا صب طاف
- بيليه جافة لمدة 7 دقائق
- في 20 ميكرولتر المياه DEPC إعادة تعليق ،
- الدوامة لمزج
- للتحقق من وجود riboprobe ، تشغيل حل إعادة علقت على 1 ٪ هلام ملون تاي مع بروميد إيثيديوم
3. جبل بأكمله في الموقع التهجين
الجزء الأول : التثبيت من الأجنة وبروتين الهضم K
(الوقت المطلوب : إصلاح بين عشية وضحاها بالإضافة إلى 4 ساعات في اليوم التالي للتخزين ، و 2.5 ساعات من التخزين إلى الجزء الثاني)
- نظم جمع الأجنة الزرد والإصلاح في بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية
- غسل الأجنة ثابتة في الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 0.1 ٪ توين - 20 (PBSt) 3 مرات لمدة 10 دقيقة كل
- لضمان تعرض الأجنة للكواشف التجريبية والأجنة dechorionate يدويا (إذا لزم الأمر) باستخدام غرامة ذات الرؤوس ملقط
- يذوى الأجنة عن طريق الغسيل في سلسلة متدرجة من 25 ٪ والميثانول بنسبة 50 ٪ في PBSt لمدة ساعة كل الغسيل ، ثم تخزن في الميثانول بنسبة 100 ٪ عند -20 درجة مئوية
- عندما تصبح جاهزة للاستخدام ، ترطيب الأجنة في PBSt عن طريق الغسيل في 50 ٪ (2 مرة) و 25 ٪ (1 مرة) الميثانول في PBSt لمدة 10 دقيقة لكل منهما. أخيرا يغسل 2 مرات لمدة 10 دقيقة في كل PBSt 100 ٪. التوقيت الدقيق ليست مهمة لPBSt / الميثانول يغسل
- الأجنة في محلول التبييض بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 10 ٪ في PBSt ، إذا لزم الأمر ، لإزالة الصبغات الداكنة. وينبغي أن الأجنة في احتضان حل بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10-20 دقيقة ، اعتمادا على عمر الجنين ، وغطاء للأنبوب microfuge ينبغي أن يظل مفتوحا لمنع تراكم الضغط الجوي
- المخفف الأجنة هضم مع 50 ملغ / مل K بروتيناز 1:5000 في PBSt ل3-15 دقائق ، اعتمادا على عمر الجنين
- إعادة إصلاح الأجنة في PFA 4 ٪ لمدة 30 دقيقة ، ثم يغسل 3 مرات في PBSt لمدة 5 دقائق كل
الجزء الثاني : من التهجين Riboprobes
(الوقت المطلوب : زائد 3 ساعات بين عشية وضحاها لتهجين ، و 1.5 ساعة في اليوم التالي إلى الجزء الثالث)
- Prehybridize الأجنة مع الحل prehybridization (PHS) في 70 مسخن مياه حمام ° مئوية لمدة 2-3 ساعات
- إزالة PHS ، إضافة 0.5 مل من محلول التهجين و 1.5 توليفها من قبل Digoxigenin ميكرولتر riboprobes المسمى ، احتضان عند 70 درجة مئوية خلال الليل. درجة الحرارة يمكن أن تتقلب في غضون بضع درجات اعتمادا على الهدف riboprobe
- في اليوم التالي ، وغسل الأجنة عند 70 درجة مئوية في حلول متدرجة من 75 ٪ ، 50 ٪ ، و 25 ٪ في PHS 2X سيترات الصوديوم المالحة (SSC) لمدة 10 دقيقة لكل منهما ، ثم يغسل في SSC 0.2X لمدة 30 دقيقة في 68 ° C
- يغسل في مخزن حمض المالئيك (ماب) 2 مرات لمدة 10 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة
الجزء الثالث : مكافحة Digoxigenin (α - DIG) الحضانة جسم
(الوقت المطلوب : زائد 3 ساعات بين عشية وضحاها إلى كتلة ، و 2.5 ساعة في اليوم التالي إلى الجزء الرابع)
- نقل الأجنة إلى جانب لوحة 12
- قبل كتلة الأجنة في حل مل 1-2 حظر ما لا يقل عن 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة
- في وقت واحد ، قبل كتلة الجسم المضاد من خلال إعداد المجلد الثاني من الحل الحجب وتمييع لمكافحة digoxigenin 1:2000 الأضداد في هذا الحل
- قبل إزالة كتلة وإضافة 1-2 مل قبل حظر α - DIG الحل ، بين عشية وضحاها في احتضان 4 درجات مئوية
- في اليوم التالي ، وغسل الأجنة في ماب. السماح للأجنة لاحتضان في ماب لمدة 5 دقائق الأولى ، ثم تنفيذ التغييرات العازلة واحتضان لمدة دقيقة 10 الاثنين ، 30 دقيقة واحدة واحدة الفاصل الزمني 60 دقيقة. التوقيت الدقيق ليست ضرورية
- غسل الأجنة 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل من القلوية العازلة (ا ف ب) الفوسفاتيز
الجزء الرابع : تلطيخ والتجهيز النهائي
(الوقت المطلوب : 1 ساعة ليلة وضحاها لتلطيخ ، اعتمادا على riboprobe المستخدمة ، يمكن تخزين 4 ساعات لبداية يغسل الجلسرين ، 6-10 ساعة في غسل الجلسرين ، والجلسرين)
- إضافة 1-2 مل تلطيخ حل للأجنة ، والتفاف لوحة في احباط ، والتحقق من تلطيخ على فترات منتظمة (كل 20 دقيقة) حتى تلطيخ غير كافية
- غسل الأجنة مع أوقات PBSt 2 لمدة 5 دقائق لكل لوقف تفاعل تلطيخ
- يذوى أجنة باستخدام 10 دقيقة يغسل في 25 ٪ (1 مرة) ، و 50 ٪ (2 مرات) الميثانول في PBSt ، ثم في الميثانول بنسبة 100 ٪ ، لإزالة تلوين الخلفية
- السماح لاحتضان الأجنة في الميثانول بنسبة 100 ٪ على الأقل 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة
- في ترطيب PBSt يغسل به 10 دقيقة في 50 ٪ (2 مرة) و 25 ٪ (1 مرة) الميثانول في PBSt ، ثم تغسل في 100 ٪ PBSt 2 مرات
- نقل البريد الملونmbryos إلى حل الجلسرين 80 ٪ في PBSt ، وذلك باستخدام سلسلة متدرجة من يغسل ، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
وصفات :
- لوحات - 10 أغار أغار LB LB ز + 250 مل من الماء المقطر ، الأوتوكلاف ، عندما تبرد إلى إضافة لمسة أمبيسلين 250 ميكرولتر ، صب 15-20 مل حل الدافئة في كل طبق بتري ، والسماح لترسيخ آغار
- حساء مرق - LB LB 12.5 غرام + 200 مل من الماء المقطر ، الأوتوكلاف ، والسماح لتبرد قبل الاستعمال
- 1 ٪ تاي هلام agarose 0.4 ز ، 40 مل 1X TAE ، 2 بروميد إيثيديوم ميكرولتر ؛ تحميل 7 ميكرولتر البلازميد (البلازميد تحول الهدف [كدنا]) أو 3 و 4 riboprobe ميكرولتر المياه DEPC ميكرولتر (في الموقع المسمى DIG التجميعي دقق RNA) + 1 صبغة تحميل ميكرولتر ، 5 ميكرولتر سلم DNA
- Prehybridization حل - 50 ٪ formamide ، SSC 5X ، 9.2mM حمض الليمون ، 1 ٪ توين - 20
- التهجين الحلول prehybridization حل زائد 500 ميكروغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال و 50 ميكروغرام / مل هيبارين
- MAB - 100mM حمض المالئيك ، 150mM كلوريد الصوديوم ، هيدروكسيد الصوديوم 0.2M ، 0.1 ٪ توين - 20 ، ودرجة الحموضة إلى 7.5
- حجب الحل - 3 أجزاء MAB ، 1 جزء كاشف بورنغير 10 ٪ حظر في MAB ، 1 حرارة الجزء المعطل الضأن المصل
- AP - 60mM تريس العازلة ، إلى 9.5 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك ، 60mM كلوريد الصوديوم ، 30mM MgCl 2 ، 0.1 ٪ توين - 20
- تلطيخ الحل - 5 - برومو كلورو - 4 - - 3 - indolyl الفوسفات (BCIP) ونيترو الزرقاء tetrazolium (NBT) في AP العازلة
4. الممثل النتائج
عندما يقوم بشكل صحيح ، فإن التفاعل بين NBT ، BCIP ، والفوسفاتيز القلوية تشكيل يعجل الأرجواني التي يجب أن تظهر على الجنين والزرد وصمة الأرجواني. وينبغي توليفها Riboprobes سابقا من [كدنا] المقابلة لهذا الجين من الفائدة. لذا ، يمكن الاستنتاج أن أي تصور يمثل وصمة عار مناطق الزرد التي تم نسخها الجين الاهتمام في هذه المرحلة التنموية التي وجه الخصوص. لأغراض هذه الدورة التدريبية ، تم توليفها من riboprobes aldh1a2 (raldh2 سابقا ؛ Begemann وآخرون ، 2001 ؛. الشكل 1) ؛ fgf8a (Reifers وآخرون ، 1998 ؛. الشكل 2) ؛ deltaC (أوتس وآخرون ، 2005) ؛ myod1 (واينبرغ وآخرون ، 1996) ؛ shha (كراوس وآخرون ، 1993) ، pax2a (الماركة وآخرون ، 1996 ؛. الشكل 3) وmyl7 (cmlc2 سابقا ؛. Yelon وآخرون ، 1999) [كدنا]. وكان من المتوقع تلطيخ في خط الوسط والهياكل التشريحية بما في ذلك somites ، tailbud ، myotome والدماغ والقلب. وكان من المتوقع أن يكون المسوخ Ace/fgf8a عيوب في كثير من هذه الهياكل. وكان من السهل تصور التلوين باستخدام مجهر تشريح القياسية. مصادر إضافية تحتوي على مزيد من المعلومات وحلول للمشاكل على رغبة تقنيات مشابهة لتلك الموصوفة هنا (كلارك ، 2003 ؛. دكوستا وآخرون ، 2009 ؛ Schmoldt وآخرون ، 2009 ؛. Schoenwolf ، 2009).
الشكل 1. جنين الزرد آخر 24 ساعة الإخصاب ، والتي تم تهجينها مع riboprobes محددة لaldh1a2. ويمكن رؤية محددة في تلوين العينين والدماغ المؤخر ، الزعانف الصدرية primordia برعم ، وsomites. الأمامي هو أعلى ، هو الخلفية إلى الأسفل.
الشكل 2. الزرد جنين في المرحلة 13 من الجسيدة التنمية التي تم تهجينها مع محددة لتحقيق fgf8a. وينظر الى تلطيخ محددة في telencephalon ، الدماغ البيني الظهرية ، الدماغ المتوسط ، الدماغ المؤخر الحدود ، somites وtailbud. بطني وإلى اليسار ، والظهرية وإلى اليمين.
الشكل 3. وآخر 22 ساعة التسميد الجنين الزرد التي تم تهجينها مع riboprobe محددة لpax2a ، علامة قوية مفيدة لتصور النظام العصبي. ويمكن رؤية محددة في تلطيخ شق المشيمية ، الدماغ المتوسط ، الدماغ المؤخر الحدود ، الحويصلة الأذنية ، والخلايا العصبية في النخاع الشوكي. عرض مع الظهرية الأمامية إلى اليسار.
المناقشة
استُخدمت تقنية WISH في مساق مختبري لبيولوجيا الفقاريات المقارنة لمساعدة الطلاب على فهم أدوار الوراثة في التطور التشريحي من خلال تصور أنماط التعبير الجيني المعروفة. في الجزء الأول من المساق، أجرى الطلاب عمليات تشريح على كائنات تمثل عدة مجموعات تصنيفية مختلفة من الحبليات، مما أتاح لهم وقتاً كافياً لدراسة تشريح الفقاريات وفهمه ومقارنته وإبراز أوجهه الاختلاف.
كمقدمة للجزء الثاني من الدورة، تلقى الطلاب محاضرة رسمية تصف نمو وتشريح سمكة الزيبرا. كما تمت مناقشة طرق ونتائج تجربة WISH المتوقعة. ثم مُنح الطلاب أسماك زيبرا حية في مراحل التكون القطعي (somitogenesis) ومرحلة prim-6 من النمو، وفي اليومين 2 و 5 بعد الإخصاب (dpf) لفحصها تحت المجهر التشريحي. كان الهدف من ذلك هو إعطاء الطلاب فهماً أفضل لشكل أجنة سمكة الزيبرا وأنواع التغيرات المورفولوجية التي تحدث خلال التطور الجنيني.
في الجلسة المختبرية التالية، تم إعطاء الطلاب أجنة سمك الزيبرا التي سبق إجراء تقنية WISH عليها. وطُلب منهم دراسة ووصف أنماط التعبير الجيني لكل جين مستهدف (المسبار الريبوزي المستخدم). اشتُقّت الأجنة المستخدمة في تقنية WISH من تزاوجات بين أفراد من سلالة ace/fgf8a متغايرة الزيجوت. وبناءً على الوراثة المندلية، كان من المتوقع أن يكون 25% من الأجنة الناتجة عن تزاوجات ace/fgf8a طفرات متماثلة الزيجوت وأن تظهر عيوبًا في العديد من التراكيب التشريحية التي ركز عليها هذا المقرر. وبناءً على التقارير المنشورة والملاحظات غير المنشورة في مختبر Albertson، كان من المتوقع حدوث عيوب في الدماغ والتفاف غير سليم للقلب، بالإضافة إلى عيوب في القطع العضلية (Brand et al., 1996; Albertson and Yelick, 2005; ملاحظات شخصية).
طُلب من الطلاب فحص جميع العينات، سواء كانت من النوع البري (حيث لا يمكن تمييز الحيوانات متغايرة الزيجوت عن أشقائها من النوع البري في المراحل المبكرة من النمو) أو الطفرات متماثلة الزيجوت، لكل نمط من أنماط التعبير الجيني المعروضة. ثم طُلب منهم كتابة تقارير مخبرية تصف نتائجهم، وتوضح بناءً على معرفتهم بالتشريح وعلم الوراثة، كيف يمكن أن يكون التعبير الجيني المعيب قد أدى إلى حدوث تشوهات تشريحية.
يبدو أن الطلاب قد استقبلوا هذا التمرين المختبري بحماس وفضول. فمعظمهم لم يسبق لهم استخدام تقنية WISH من قبل، وكانوا مهتمين للغاية بهذا الجزء من المساق. وقد وجد الطلاب أن الأنماط المختلفة للتعبير الجيني في أجنة أسماك zebrafish مثيرة للاهتمام، بل وصف بعضهم أنماط التلوين التي تمت رؤيتها من خلال ربطها بتصاميم ورموز معروفة، مثل الوجه المبتسم. وأظهرت التقارير المختبرية الناتجة أن الطلاب قد اكتسبوا فهماً عاماً لبروتوكول WISH والتعبير عن الجينات في هياكل تشريحية محددة. كما طُلب من الطلاب فهم الوظائف المحددة للجينات التي تمت دراستها باستخدام WISH خلال المختبر (Stickney et al., 2000; Huelsken et al., 2002; Geetha-Loganathan et al., 2008a; Geetha-Loganathan et al., 2008b). ومع ذلك، كان من الواضح أن بعض الطلاب لديهم معرفة خلفية محدودة بمسارات الإشارة والجينات محل الاهتمام. وقد تكون إضافة المزيد من المعلومات حول هذه المفاهيم في المحاضرة التمهيدية لتقنية WISH إضافة مفيدة لاستخدام WISH في مساقات بيولوجيا الفقاريات المقارنة مستقبلاً.
بما أن البروتوكول يستغرق عمومًا أربعة أيام متتالية، وبناءً على جدول الدورة التدريبية، قد يتمكن الطلاب من إكمال جزء فقط من التجربة داخل الفصل، ويتحمل المحاضر مسؤولية بقية الخطوات. في فصل بيولوجيا الفقاريات المقارنة لدينا، أكمل الطلاب تفاعلات التلوين في المختبر، بينما قام مساعد التدريس بجميع الخطوات السابقة. وإذا كان من المفضل أن يقوم الطلاب بإجراء عملية التهجين الموضعي لسلسلة الحمض النووي الريبي (WISH) في الفصل، فيمكن تقسيم البروتوكول إلى وحدات فرعية يمكن تنفيذها على مدار عدة جلسات مختبرية، اعتمادًا على الإطار الزمني للفصل. وفي حال عدم إمكانية قيام الطلاب بتنفيذ البروتوكول كاملاً، كما كان الحال هنا بسبب اجتماع المختبر مرة واحدة فقط في الأسبوع، يمكن للطلاب إضافة محلول التلوين في بداية الفصل، وبناءً على المسبار الريبوزي (riboprobe) المستخدم، يمكن أن يكتمل التلوين في غضون ساعة واحدة. ويختلف الوقت الذي يستغرقه ظهور اللون بشكل كبير مع كل مسبار ريبوزي ومجموعة متنوعة من الظروف التجريبية، لذا يجب تحديده مسبقًا قبل الفصل. ومن الجدير بالذكر أنه إذا كان الطلاب سيقومون فقط بتطوير التلوين في المختبر، فسيكون المحاضرون مسؤولين عن جميع الخطوات السابقة، وهو ما يتطلب وقتًا وجهدًا كبيرين خارج الفصل الدراسي. وإذا رغبتم في ذلك، يمكن أن يكون البديل الأقصر لعملية WISH هو الكيمياء النسيجية المناعية، باستخدام علامات الأجسام المضادة لتصور تموضع البروتين، ومع ذلك، فإن الأجسام المضادة الخاصة بأسماك zebrafish للجينات النمائية ليست متاحة بسهولة في الوقت الحالي. وهناك خيار آخر يتمثل في إجراء WISH على أنواع مختلفة من الفقاريات وجعل الطلاب يقارنون أنماط التعبير لنفس الجينات في كائنات مختلفة (Pizard et al., 2004; Aramaki et al., 2007; Emerging Model Organisms, 2008; Emerging Model Organisms, 2010).
كان الهدف الشامل من استخدام تقنية WISH في مساق بيولوجيا الفقاريات المقارنة هو توضيح كيفية استخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية لدراسة التطور التشريحي للطلاب. كما أتاح ذلك فرصة للطلاب للتكهن بكيفيةما قد يؤدي به التعبير الجيني المتغير ليس فقط إلى تشوهات نمائية، بل وأيضاً إلى تغير تطوري. يهدف هذا المجال الدراسي سريع النمو، والذي تمت صياغته كبيولوجيا التطور والنمو (ويشار إليه غالباً باسم "evo-devo")، إلى ربط النمط الجيني بالنمط الظاهري من خلال عملية النمو، وتوضيح الأسس الميكانيكية المحتملة للتغير التطوري. ومع صعود هذا المجال، بدأ المزيد من علماء البيئة وبيولوجيا الكائنات الحية وعلماء الفسيولوجيا في توظيف التقنيات الجزيئية في أبحاثهم. ونحن نرى أن استخدام WISH في مساق بيولوجيا الفقاريات المقارنة سيساعد في إبقاء المنهج الدراسي محدثاً وفقاً للتطورات التكنولوجية والمفاهيمية الحالية في الأبحاث، وتسهيل مواءمة أفقية أفضل لمساقات البيولوجيا في المستويات العليا من خلال الدمج بين المجالات الفرعية للبيولوجيا. علاوة على ذلك، سيوفر هذا النهج المتكامل للطلاب الفرصة لتعلم مجموعة متنوعة من تقنيات البحث البيولوجي في مساق واحد، مما يؤدي إلى تعليم أكثر تنوعاً وتعزيز البحوث العلمية المستقبلية متعددة التخصصات.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يود المؤلفون تقديم الشكر لقسم علم الأحياء في جامعة سيراكيوز والدكتورة ماريلين كير لأدوارهم في إدارة مساق علم الأحياء المقارن للفقاريات. يتلقى مختبر ألبرتسون الدعم من خلال المنحة R21DE019223 المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة/المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والجمجمة، بالإضافة إلى المنحة R01AG031922 المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة/المعهد الوطني للشيخوخة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طقم 5 Prime Fast Plasmid Mini (100 تحضيرة) | Fisher Scientific | 2300000 | |
| بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) من سلالة TOP10 ذات الكفاءة الكيميائية One Shot مع وسط SOC الغذائي | Invitrogen | C404003 | |
| آجار LB | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| مرق LB | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| ملح صوديوم الأمبيسيلين | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| إيزوبروبانول | Acros Organics | 42383-0010 | |
| طبق بتري 100 × 20 مم غير معالج | مبيعات المنتجات المختبرية | 430591 | |
| أنبوب زراعة سعة 14 مل، بغطاء كبس | Fisher Scientific | 1495911B | |
| إنزيمات القطع &المحاليل المنظمة &ألبومين المصل البقري (BSA) بتركيز 10x | New England Biolabs | يختلف | |
| ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) ٢٥ مل | Sigma-Aldrich | D5758-25مل | |
| خلات الصوديوم ثلاثية الهيدرات USP/FCC 500 جم | Fisher Scientific | s608500 | |
| جالون من الكحول الإيثيلي بنقاء 200% | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| محلول Tris-Acetate-EDTA (TAE) بتركيز 50x، حجم 1 لتر | Fisher Scientific | bp13321 | |
| أجاروز منخفض الكهرومغناطيسية الكهربائية (Low EEO) ١٠٠ جم | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| بروميد الإيثيديوم 10 مل | Sigma-Aldrich | 45-E1510 | |
| صبغة تحميل هلام السكروز، 40% سكروز | Fisher Scientific | BP655-1 | |
| سلم الحمض النووي DNA بمدى كامل 1 كيلوباز (1 kb Full Scale DNA Ladder) | Fisher Scientific | BP2582200 | |
| مزيج وسم الحمض النووي الريبي بـ DIG | مجموعة روش | 11277073910 | |
| إنزيم بوليميراز الحمض الريبي النووي T3 | مجموعة روش (Roche Group) | 1031163 | |
| إنزيم T7 RNA Polymerase | مجموعة Roche | 10881767001 | |
| إنزيم SP6 RNA polymerase | مجموعة روش | 810274 | |
| مثبط الرناز Protector | مجموعة Roche | 3335399001 | |
| دي إن آيز 1 (Dnase I)، خالية من الرنايز (Rnase Free)، 10,000 وحدة | مجموعة Roche | 4716728001 | |
| كاشف EDTA للبيولوجيا الجزيئية | Sigma-Aldrich | e5134-500G | |
| كلوريد الليثيوم 100 جم | Fisher Scientific | L121100 | |
| كربونات الصوديوم 1 كجم | Fisher Scientific | BP357-1 | |
| بيكربونات الصوديوم، 500 جم | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| حمض الأسيتيك الجليدي ACS سعة 500 مل | Fisher Scientific | a38500 | |
| بارافورمالدهيد R 500 جم | Fisher Scientific | يرجى تقديم النص المصدر المراد ترجمته. لقد زودتني فقط برمز (o4042500)، وهو لا يحتوي على محتوى نصي للترجمة. أنا مستعد للبدء فور تزويدي بالنص الإنجليزي. | |
| محلول منظم ملحي فوسفاتي (PBS) بتركيز 10X | Fisher Scientific | bp3991 | |
| Tween 20 سعة 500 مل | Fisher Scientific | bp337500 | |
| ميثانول 5 لتر | Fisher Scientific | A4124 | |
| بروتيناز ك 50 ملغ | Fisher Scientific | bp170050 | |
| فورماميد 1 لتر | Fisher Scientific | F841 | |
| 1 لتر من محلول SSC بتركيز 20x | Fisher Scientific | bp13251 | |
| حمض الستريك اللامائي ACS 500 جم | Fisher Scientific | a940500 | |
| حمض ريبونوكلييك ناقل من النوع الخامس | Sigma-Aldrich | r7876-2.5KU | |
| ملح صوديوم الهيبارين 50 مجم | Fisher Scientific | bp252450 | |
| حمض المالييك R ٥٠٠ جم | Fisher Scientific | يرجى تقديم النص المصدر الذي ترغب في ترجمته. لقد زودتني برمز فقط (o3417500)، وأنا مستعد لبدء الترجمة فور تزويدي بالمحتوى العلمي المطلوب. | |
| كلوريد الصوديوم 500 جم | Fisher Scientific | s271500 | |
| هيدروكسيد الصوديوم 500 جم | Fisher Scientific | s318500 | |
| كاشف الحجب | مجموعة روش | 11096176001 | |
| مصل غنم 500 مل | Invitrogen | 16070096 | |
| شظايا الجسم المضاد لـ DIG AP | مجموعة Roche | 11093274910 | |
| محلول تريس بتركيز 2 مولار، 500 مل | Fisher Scientific | bp1759500 | |
| كلوريد المغنيسيوم 500 جم | Fisher Scientific | m33500 | |
| 3 مل من BCIP | مجموعة روش (Roche Group) | 11383221001 | |
| 3 مل من NBT | مجموعة روش (Roche Group) | 11383213001 | |
| جليسرول 99% 2.5 لتر | Fisher Scientific | AC158920025 | |
| طبق 12 بئراً من البوليستيرين المعالج (PS ST) مع غطاء | VWR international | 62406-165 | |
| أنبوب 15 مل بغطاء لولبي 50/ حامل 500/ صندوق | مبيعات المنتجات المختبرية | L262861 | |
| أنبوب 50 مل بغطاء لولبي 25/حامل 500/صندوق | مبيعات المنتجات المختبرية | L262890 | |
| أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.6 مل | مبيعات المنتجات المختبرية | L234401 | |
| 2 Parafilm 2" × ٢٥٠ قدم | Fisher Scientific | s37441 | |
| ماصة نقل 7 مل | USA Scientific, Inc. | 1020-2520 | |
| .1-10 μرؤوس ماصات، كميات كبيرة | USA Scientific, Inc. | 1111-3000 | |
| 1-200 μرؤوس ماصات، كمية كبيرة | USA Scientific, Inc. | 1111-0006 | |
| 101-1000 μرؤوس ماصات، كميات كبيرة | USA Scientific, Inc. | 1111-2021 | |
| رقائق الألومنيوم | متجر مواد غذائية | ||
| <قائمة غير مرتبة><لي>الموصدة (أوتوكلاف)<قائمة>جهاز طرد مركزي دقيق<ليثيوم>37°حضّانة ثاني أكسيد الكربون (مع هزّاز)<لي>4°جهاز طرد مركزي دقيق C<لي>حمام مائي<ليثيوم>رجّ دوامي<قائمة>جهاز الفصل الكهربائي للهلام<قائمة>-20°مجمد C<لي>-80°مجمد -C<لي>هزاز/رجاج<قائمة>4°ثلاجة درجة حرارة C<قائمة>مجهر تشريحي (يفضل أن يكون مزوداً بشاشة تعليمية أو كاميرا) |
المراجع
- Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
- Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).
- Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain. Development. 128, 3081-3094 (2001).
- Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain. Development. 123, 179-190 (1996).
- Clark, M. In situ Hybridization: Laboratory Companion. , Wiley-VCH. (2003).
- D'Costa, A., Shepherd, I. T. Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class. Zebrafish. 6, 169-177 (2009).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. Wnt signaling in limb organogenesis. Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. Wnt signaling in somite development. Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.
- Huelsken, J., Behrens, J. The Wnt signaling pathway. J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation. Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).
- Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).
- Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis. Development. 125, 2381-2395 (1998).
- Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills. Zebrafish. 6, 187-199 (2009).
- Schoenwolf, G. C. Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos. Development. 122, 271-280 (1996).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
