استراتيجية لتحديد الطفرات دي نوفو في الاضطرابات الشائعة مثل التوحد والفصام

ملخص

الوراثية الجزيئية لإيجاد استراتيجية دي نوفو طفرات تسبب الاضطرابات الشائعة مثل التوحد وانفصام الشخصية.

الملخص

هناك عدة أدلة تدعم دور الطفرات de novo كآلية للاضطرابات الشائعة، مثل التوحد والفصام. أولاً، يعد معدل الطفرات de novo لدى البشر مرتفعاً نسبياً، لذا تتولد طفرات جديدة بتردد عالٍ في المجتمع. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عن طفرات de novo في معظم الأمراض الشائعة. إن الطفرات في الجينات التي تؤدي إلى أمراض شديدة حيث يوجد انتخاب سلبي قوي ضد النمط الظاهري، مثل الوفاة في المراحل الجنينية أو انخفاض الكفاءة التكاثرية، لن تنتقل إلى العديد من أفراد الأسرة، وبالتالي لن يتم اكتشافها عن طريق رسم خرائط الجينات الارتباطية أو دراسات الارتباط. كما أن ملاحظة التطابق العالي جداً في التوائم أحادية الزيغوت والتطابق المنخفض جداً في التوائم ثنائية الزيغوت تدعم بقوة الفرضية القائلة بأن جزءاً كبيراً من الحالات قد ينتج عن طفرات جديدة. وهذا هو الحال في أمراض مثل التوحد والفصام. ثانياً، على الرغم من انخفاض الكفاءة التكاثرية¹ والعوامل البيئية المتغيرة للغاية، فإن معدل حدوث بعض الأمراض يظل ثابتاً ومحافظاً عليه عالمياً بمعدل مرتفع نسبياً. وهذا هو الحال بالنسبة للتوحد والفصام، بمعدل حدوث يبلغ حوالي 1% عالمياً. يمكن اعتبار الحمل الطفري بمثابة توازن بين الانتخاب المؤيد أو المعارض للطفرة الضارة وإنتاجها عن طريق طفرة de novo. وتعتبر معدلات التكاثر المنخفضة عاملاً من عوامل الانتخاب السلبي التي من شأنها أن تقلل عدد الأليلات الطافرة في المجتمع، مما يؤدي في النهاية إلى انخفاض انتشار المرض. وتميل هذه الضغوط الانتخابية إلى أن تكون ذات شدة مختلفة في البيئات المختلفة. ومع ذلك، فقد حافظت هذه الاضطرابات العقلية الشديدة على انتشار ثابت ومرتفع نسبياً في المجتمع العالمي عبر مجموعة واسعة من الثقافات والبلدان على الرغم من الانتخاب السلبي القوي ضدها². وهذا ليس ما يمكن توقعه في الأمراض التي تعاني من انخفاض الكفاءة التكاثرية، ما لم يكن هناك معدل مرتفع للطفرات الجديدة. وأخيراً، تأثيرات عمر الأب: هناك زيادة ملحوظة في خطر الإصابة بالمرض مع زيادة عمر الأب، وهو ما قد ينتج عن الزيادة المرتبطة بالعمر في طفرات de novo الأبوية. وهذا هو الحال في التوحد والفصام³. ويُقدر معدل الطفرات بين الذكور والإناث بنحو 4-6:1، ويفترض أن ذلك يعود إلى عدد أكبر من انقسامات الخلايا الجرثومية مع تقدم العمر لدى الذكور. وبناءً على ذلك، يُتوقع أن تأتي الطفرات de novo بشكل متكرر من الذكور، وخاصة الذكور الأكبر سناً⁴. وقد يفسر المعدل المرتفع للطفرات الجديدة جزئياً سبب فشل الدراسات الجينية حتى الآن في تحديد العديد من الجينات المسببة للأمراض المعقدة، مثل التوحد والفصام، وسبب تحديد الأمراض لـ 3% فقط من الجينات في الجينوم البشري. يتطلب تحديد الطفرات de novo كسبب للمرض منهجاً جزيئياً مستهدفاً، يتضمن دراسة الوالدين والأشخاص المصابين. سيتم توضيح عملية تحديد ما إذا كان الأساس الجيني للمرض قد ينتج جزئياً عن طفرات de novo والمنهج الجزيئي لإثبات هذا الارتباط، باستخدام التوحد والفصام كأمثلة.

البروتوكول

1. اختيار الأمراض التي قد تسببها طفرات دي نوفو

ويمكن للمرض الذي يتوافق مع المعايير التالية تتناسب مع الطفرة فرضية دي نوفو :

1. هو انخفاض اللياقة البدنية الإنجابية.
2. تواتر المرض مرتفعة نسبيا وثابتة على الرغم من اختلاف البيئات على نطاق واسع.
3. يترافق هذا المرض مع التقدم في السن أعلى الأب.
4. فشل الربط الكلاسيكي وجمعية دراسات لشرح جزءا كبيرا من وراثة المرض.
5. بيانات دعم التوافق التوأم نموذجا نوفو دي.

تحليل لاحتمال مرض شائع حيث دي نوفو الطفرات قد تساهم جزئيا في تفسير الأساس الجيني هو خطوة أولى حاسمة.

2. اختيار الحالات وعينات من الحمض النووي

اختيار العينات المناسبة أمر بالغ الأهمية لنجاح تحديد الطفرات نوفو دي. لتعظيم فرصة العثور دي نوفو الطفرات ، فإننا نوصي بما يلي :

1. حدد الحالات مع التقدم في السن المبكرة من النمط الظاهري ، بداية حادة ، مع والديه لم تتأثر ، وكبار السن والآباء وليس لهم تاريخ العائلة الموسعة لهذا المرض.
2. اختيار المرضى الذين يعانون من السلطات الوطنية المعينة المتوفرة كافية لإجراء الدراسة. أهمية خاصة هو توافر من الحمض النووي من مصدر الخلايا الأولية التي لم تكن تخضع لزراعة (مثل الحمض النووي DNA الدم أو اللعاب) ،
3. توفر كل من الحمض النووي أولياء الأمور الحاسمة من أجل تحديد حالة انتقال الطفرة (الموروثة مقابل دي نوفو). توافر الأفواج المتضررة إضافية وعناصر طبيعية ضرورية للدراسات الجينية التحقق من مرة واحدة يتم تحديد الجينات مرشح.
4. تقدير حجم العينة على أساس معدل الطفرات ، فإن كمية من الجينات لفحص وتقدير لنسبة ضئيلة من الحالات التي قد تنجم عن طفرة نوفو دي.

3. الجينات resequencing ؛ منهجين رئيسيين

1. عالية الجودة الإنتاجية المنخفضة التسلسل
   ويستند هذا النهج على المرشح الجينات النهج.
   1. اختيار مرشح الجينات (ق)
      تحديد جينات أفضل المرشحين استنادا إلى نظام تسجيل النقاط التي بنيت في 6 المعايير الرئيسية. ثم حساب المجموع التي تتوافق مع مجموع نقاط جميع عزا باستخدام المعايير الستة المدرجة في الجدول 1. انظر مثلا من مشروعنا في الشكل 1 التوزيع المختارة وتحديد الجينات لا.
      
      الجدول 1. المعايير المستخدمة لاختيار مرشح الجينات
      
      
      الشكل 1. رسم بياني يبين توزيع الجينات مختارة ومنتقاة ليس في التسلسل في مشروعنا. حصلنا على توزيع الجينات مرتبة حسب خصائص مرشح الجينات الفرز وفقا لقيمة علاماتهم. على سبيل المثال ، كان SHANK3 NRXN1 والجينات ، واثنين من الجينات التي وجدنا طفرة دي نوفو ، على درجة 7 و 6 على التوالي (الحد الأقصى هو 12).
   2. الاشعال تصميم البرمجيات من خلال استخدام Primers3 Exonprimer. الترميز فقط المنطقة وينبغي أن تكون مشمولة بما في ذلك لصق تقاطع أزواج من خارج القاعدة 50 على كل جانب من اكسون.
   3. تحسين ظروف PCR لاختيار طق ، حجم رد الفعل ، الخ.
   4. تحسين كافة شظايا PCR
   5. تضخيم 5 نانوغرام من الحمض النووي المستخرج من الجينومية عينات الدم وفقا للاجراءات المتبعة
   6. قبل إرسالها للتسلسل ، لا مراقبة جودة المنتجات التي PCR تحميل 2 ٪ agarose هلام. عينات مختارة عشوائيا.
   7. تسلسل المنتجات PCR على محلل الحمض النووي على أحد حبلا. ويعتبر جزء التسلسل بنجاح إذا كان التحليل أكثر من 90 ٪ من آثار غير ممكن. هذا ينطبق على عملية غربلة واسعة النطاق.
   8. الكشف عن المتغيرات
      1. استخدام أدوات لكشف والتنميط الجيني للتغيرات الجينومية مثل PolyPhred ، ومساح Polyscan الطفرة. مزيج من أدوات للكشف عن أكثر من 2 مثالية. على سبيل المثال ، وPolyPhred PolyPhred v.5 v.6 مع الإعدادات الافتراضية لا يكشف عن اختلافات نفسه. Polyscan V.3 لديها أعلى معدل طفرة ايجابية كاذبة لالنيوكلوتايد (96 ٪) وأقل لINDELs (93 ٪). ولم يتم الكشف عن PolyPhred v.6 غالبية INDELs صحيح ولكن لديها طفرة ايجابية كاذبة معدل (لINDELs) أقل من العام V.3 Polyscan (90 ٪). وينبغي أن نلغي خيار الكشف عن النيوكلوتايد Polyscan V.3 والحفاظ على حد سواء وPolyPhred PolyPhred v.5 v.6 لكشف متغير. مساح الطفرات وPolyscan أفضل للكشف عن indels. ملاحظة : يجب أن لا خيار للكشف عن الحزب الوطني الاسكتلندي تطبيقها عند استخدام Polyscan. فقط يجب أن "indel" الخيار يكون على. ولدت لPolyscan ايجابية كاذبة للكشف عن العديد من الحزب الوطني الاسكتلندي.
      2. لكل exonic رواية فريدة الكشف عن المتغيرات ، تأكيدها يدويا بواسطة reamplifying جزء وresequencing في المستلفت وكلا الوالدين باستخدام بادئات العكسي وإلى الأمام للقضاء على أي قطعة أثرية فنية.
2. تسلسل كامل exome
   هذا النهج هو التسلسل إنتاجية عالية تستهدف غالبية الترميز مناطق الجينوم البشري. نحن الآن حاليا باستخدام هذا النهج الجديد في المختبر ، والإسراع في الكشف عن الجينات المرشحة المحتملة.
   1. النظام "SureSelect الإنسان جميع اكسون" التي تستهدف المنطقة من خلال الترميز 16000 الجينات (50 ميغابايت من الجينوم) التي صممها اجيلنت أو أي منتج آخر مشابه من قبل الآخرين مثل روش. قبل أن تأمر عدة أسر ، ينبغي أن يكون تحديد المنصات التسلسل (البورشيد مقابل الصلبة).
   2. لا الالتقاط وفقا لبروتوكول اجيلنت
   3. تسلسل المنتج على حكوماتكم منصة الجيل المقبل المتاحة
   4. الكشف عن البديل من التسلسل exome كله : العديد من الأدوات المعلوماتية الحيوية للكشف عن الاختلافات والتنميط الجيني الجينوم التسلسل من منصة الجيل المقبل من تتوفر مثل التحالف ، Bfast ، Bioscope التي من شأنها أن تؤدي المحاذاة. وبعد ذلك ستكون هناك حاجة إضافية المصب الأدوات المتاحة بحرية (على سبيل المثال SAM الأدوات ، Varscan ، Annovar) أن الدعوة وتعليم المتغيرات. البرمجيات التجارية التي تتضمن المحاذاة تسلسل ويدعو البديل والشرح وتتوفر أيضا ، مثل الجيل القادم (Softgenetics) ، بيو CLC ، وغيرها

4. الجينومية المتغيرات الأولويات

ثم يتم ترتيب أولويات المتغيرات المحددة للمتابعة وفقا لاحتمال يجري في دي نوفو وضارة وظيفة البروتين أو مرنا و / أو بنية. المتغير متابعة الأولويات للكشف عن البديل دي نوفو ينبغي على النحو التالي :

1. فريد الاختلافات (لاحظ مرة واحدة في حالة واحدة)
2. الاختلافات غير موجودة في والدي
3. البروتين مقطوعة الاختلافات : هراء ، مما أدى إلى انزياح الإطار indels والطفرات الربط.
4. وتوقع مغلطة والاختلاف لتكون صامتة التخريبية وظيفيا (على سبيل المثال ، تؤثر الربط مرنا). استخدام Polyphen ، فرزت والفهود من أجل التأثير على التنبؤ وظيفية للبروتين.

إذا باستخدام التسلسل exome كله ، يمكن استخدام مجموعة من الجينات المرشحة كاستراتيجية لتحديد أولويات المتغيرات لمزيد من الدراسة.

5. التحقق من صحة الوراثية

1. Resequence الجين بأكمله في حالات المرضى إضافية (لتحديد الطفرات المسببة الأخرى) والضوابط. وسوف تستخدم هذه العينات لتقييم مراقبة الترددات أليلية من المتغيرات ذات الأولوية. وينبغي أن يكون أي الجينات التي تحتوي على ما لا يقل عن اثنين من مختلف دي نوفو الطفرات الضارة (هراء ، الربط ، frameshifts ، وتوقع ضررا مغلطة) وجدت في مختلف المرضى (ولكن ليس في عينات مراقبة أو قواعد بيانات عامة) أولوية عالية للدراسات التحقق من صحة أخرى. وهذا يشمل : 1) لاختبار وجود خلل محتمل في الربط خطوط الخلايا المشتقة من lymphoblastoid المريض. في تجربتنا ، فإن معظم الجينات العائد RT - PCR المنتجات من خطوط الخلايا lymphoblastoid ؛ 2) التحقيق في تغيير مستويات بروتين تعبير عن طريق التحليل الكمي لطخة غربية مقتطفات من البروتين من خطوط الخلايا lymphoblastoid و 3) اختبار المزيد من الطفرة / الجينات على المستوى الوظيفي في الحيوانات (ج ايليجانس ، اسماك الزرد) ونماذج خط الخلية كما فعلت من قبل مجموعتنا (مثال : 5،6).

6. ممثل النتائج :

بعد هذا البروتوكول ، وكنا قادرين على تحديد جينات جديدة لمرض انفصام الشخصية والتوحد. مثال واحد هو اكتشاف الجينات لدينا مؤخرا SHANK3 (الشكل 2). مختلفتين دي نوفو طفرات في الجين SHANK3 ، واحدة الطفرة هراء وجدت في ثلاثة شقيقه وأحد المتضررين طفرة مغلطة في امرأة واحدة المتضررة.

الشكل 2. (أ) الفصل بين الطفرة هراء R1117X في ثلاثة أشقاء المتضررين من PED 419 عائلة. يشار إلى المستلفت بواسطة السهم (ب) فصل من طفرة مغلطة R536W في المستلفت ولكن ليس لها أخ غير المتضررة في PED 56.

المناقشة

الإجراء المذكورة هنا تهدف إلى التعرف على الأمراض الشائعة التي تؤدي على الأرجح محددة ، في جزء منه ، من الطفرات دي نوفو ، وتثبت هذه الفرضية. دي نوفو الطفرات هي آلية راسخة لتطوير عدد من الأمراض ، ومنها على سبيل المثال متلازمات السرطان وراثية ، ولكن لم يتم استكشافها بشكل سيئ في الأمراض الشائعة. هذه النتائج في جزء من التحديات التقنية التي ينطوي عليها تحديد الطفرات دي نوفو ، الأمر الذي يتطلب كميات كبيرة من تسلسل الحمض النووي ، والتي ليس لها إلا مؤخرا جدا أن تصبح فعالة من حيث التكلفة مع ظهور الجيل التسلسل التالي. بالإضافة إلى ذلك ، كان معدل تحور نوفو دي في البشر ، وحتى وقت قريب جدا ، مجرد تقدير. إلا مؤخرا جدا وهناك تقارير مباشرة تحديد معدل تحور في البشر. قبل هذه القياسات ، وكان من الصعب توقع حجم العينة المطلوبة لهذا النوع من الدراسة ، وتحديد ما إذا كان لاحظ تحور دي نوفو معدل أكبر من المعدل الأساسي. تسلسل الجينات مرشح مقابل الجينوم؟ لأن غالبية من الطفرات المرض المبلغ عنها مغلطة / هراء الطفرات والتحولات موقع لصق (وفقا لموقع على شبكة الإنترنت HGMD) استراتيجيتنا الفحص سيحدد أكثر من 68 ٪ من الطفرات المعروفة. هناك أيضا علاقة واضحة بين شدة استبدال الأحماض الأمينية واحتمال وجود النمط الظاهري السريرية. بالمقارنة مع استبدال الأحماض الأمينية المحافظ ، وهو تغيير هراء هو 9،0 مرات اكثر من المرجح أن يقدم سريريا 7. وهكذا ، في هذا الوقت تسلسل الجينات المرشحة هي الاستراتيجية الأكثر فعالية من حيث التكلفة.

نجاح الإجراء المذكورة تعتمد على العديد من الخطوات الحاسمة ، والتي ترد بالتفصيل ويتضح به مثالين والتوحد وانفصام الشخصية. هناك كثير من المزالق التي يجب تجنبها ، مثل المرض الذي لتحديد ، أي من المرضى الى المصدر ، على الشاشة من الحمض النووي ، وتفاصيل عن كيفية تحديد كفاءة دي نوفو الطفرات. نحن نقدم طريقة لتحديد أكفأ جزء من الحالات من أي مرض الذي ينجم عن مثل هذه الطفرات العفوية.