خلفية رفض الإسفار في الرنين وMicrospectroscopy رامان العفوي

ملخص

نناقش في هذا البحث بناء وتشغيل نظام بصري غير خطي معقد يستخدم التبديل البصري الكامل فائق السرعة لعزل إشارات رامان عن إشارات الفلورة. وباستخدام هذا النظام، تمكنا من فصل إشارات رامان والفلورة بنجاح باستخدام طاقات نبضية وقدرات متوسطة تظل ضمن الحدود الآمنة بيولوجياً.

الملخص

غالبًا ما تعاني مطيافية رامان من خلفية فلورية قوية، لا سيما في العينات البيولوجية. وإذا تم تحفيز العينة بسلسلة من النبضات فائقة السرعة، فإن النظام الذي يمكنه الفصل زمنيًا بين الإشارات المتداخلة طيفيًا على مقياس البيكو ثانية يمكنه عزل ضوء تشتت رامان الذي يصل سريعًا عن ضوء الفلورية الذي يصل متأخرًا. نناقش هنا بناء وتشغيل نظام بصري غير خطي معقد يستخدم التبديل البصري الكامل في شكل بوابة كير (Kerr gate) بصرية منخفضة الطاقة لعزل إشارات رامان والفلورية. يتم تقسيم شعاع ليزر واحد بطول موجي 808 nm وبقدرة متوسطة تبلغ 2.4 W ومعدل تكرار 80 MHz، حيث يتم تحويل ما يقرب من 200 mW من ضوء 808 nm إلى < 5 mW من ضوء 404 nm الذي يُرسل إلى العينة لتحفيز تشتت رامان. ثم يُرسل ضوء 808 nm المتبقي وغير المحول إلى وسط غير خطي حيث يعمل كمضخة للمصراع البصري الكامل. يفتح المصراع ويغلق في غضون 800 fs بكفاءة قصوى تبلغ حوالي 5%. وباستخدام هذا النظام، تمكنا من فصل إشارات رامان والفلورية بنجاح عند معدل تكرار 80 MHz باستخدام طاقات نبضية وقدرات متوسطة تظل آمنة بيولوجيًا. وبما أن النظام لا يملك سعة فائضة من حيث القدرة البصرية، فإننا نفصل عدة اعتبارات في التصميم والمحاذاة التي تساعد في تعظيم إنتاجية النظام. كما نناقش بروتوكولنا لتحقيق التداخل المكاني والزماني لشعاعي الإشارة والمضخة داخل وسط كير، بالإضافة إلى بروتوكول مفصل للاكتساب الطيفي. وأخيرًا، نعرض بعض النتائج النموذجية لأطياف رامان التي تم الحصول عليها في وجود فلورية قوية باستخدام نظام البوابة الزمنية الخاص بنا.

البروتوكول

1. يجب توخي الحذر عند تحضير عينة رامان ووضعها داخل هذا النظام.

1. بما أن النظام يستخدم عادةً عدسات شيئية ذات فتحة عددية عالية جداً ومسافات عمل قصيرة جداً، يتم وضع العينات على غطاء شريحة. وتوضع العينات البيولوجية عادةً على غطاء شريحة من السمك رقم 1 مثبت في غرفة خلية Attofluor (شركة Invitrogen، كارلسباد، كاليفورنيا).
2. أما العينات السائلة، وخاصة تلك السامة للبشر، فتوضع في زجاجة صغيرة مع لصق غطاء الشريحة بالفتحة باستخدام إيبوكسي السيليكون. ثم تُقلب الزجاجة لإجراء القياس.
3. نظراً لأن نظامنا يعتمد على التوقيت الدقيق لنبضات الضخ والإشارة، فإننا مقيدون بعدم استخدام ضبط التركيز التقليدي للمجهر، والذي يقوم بتحريك العدسة الشيئية للأعلى والأسفل، مما يؤدي إلى إضافة أو طرح مسار بصري من نظامنا. بدلاً من ذلك، نضع عيناتنا على منصة ثانوية مثبتة فوق منصة المجهر، ولها تحكم مستقل في التركيز.

2. من أجل التقاط أطياف رامان ذات البوابة الزمنية، يجب تحضير شعاع الإثارة بشكل صحيح.

1. نبدأ بضوء ينبعث من ليزر Ti:Sapph نبضي قابل للضبط بقدرة 2.4 W (Chameleon, Coherent Systems, Santa Clara, CA). كل نبضة في سلسلة النبضات بتردد 80 MHz تمتلك طاقة قدرها 30 nJ، وعرضاً زمنياً يبلغ 140 fs، وطيفاً مركزه عند 808 nm مع عرض نطاق طيفي يبلغ ~6 nm.
2. ولمنع الانعكاسات الخلفية من إعادة الدخول إلى تجويف الليزر، يمر الضوء عبر عازل فاراداي (Faraday isolator). وتسمح لوحة نصف موجية موضوعة قبل عازل فاراداي بالضبط المستمر لإجمالي القدرة المرسلة إلى النظام.
3. بما أن عرض النطاق 6 nm واسع جداً بحيث لا يسمح بتمييز معظم أنماط رامان، يتم إرسال الشعاع عبر مرشح تمرير نطاق ضيق جداً (0.8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) مركزه عند 808 nm.
4. يتم بعد ذلك تركيز الضوء بواسطة عدسة ثنائية اللون اللالونية (f = 100 mm) على بلورة β-Barium Borate (BBO) قطرها 5 mm (CASIX, Fuzhou, Fujian, P. R. China) لخفض الطول الموجي إلى النصف من 808 nm إلى 404 nm. تُوضع بلورة BBO في حامل مزود بعناصر تحكم في الإمالة والميل، كما يتم تثبيتها على منصة إزاحة. ولتحقيق أقصى قدر من كفاءة تحويل الطول الموجي، يجب وضع البلورة بشكل متماثل بدقة حول بؤرة العدسة الثنائية، مع محاذاة محور البلورة مع استقطاب الشعاع القادم.
5. بما أن كفاءة تحويل الطول الموجي تعتمد على الاستقطاب، يمكن التحكم في كمية الضوء المرسلة إلى العينة عن طريق وضع لوحة نصف موجية ثانية بعد عازل فاراداي. ومن خلال تدوير هذه اللوحة الموجية، يمكن تعديل شدة الضوء المرسل إلى العينة بشكل مستقل عن الشدة المرسلة في شعاع الضخ (والذي سيتم مناقشته أدناه).
6. يتم إعادة موازاة الضوء المحول طولياً بواسطة عدسة ثنائية اللون اللالونية ثانية (f = 500 mm) مختارة بحيث يكون الشعاع الخارج كبيراً بما يكفي لملء الفتحة الخلفية لعدسة المجهر الشيئية، ويوجه إلى مجهر مقلوب (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) بواسطة مرآتي توجيه.
7. تحدد العدسة الشيئية للمجهر، لكونها العنصر البصري الموجود داخل المكون الأكثر ثباتاً في النظام، المحور البصري. ولمحاذاة شعاع الإثارة مع هذا المحور، توضع مرآة في مستوى العينة للمجهر. ثم يتم ضبط مرآتي التوجيه بشكل تكراري أثناء مراقبة شعاع الليزر المنعكس خلفياً على كاميرا CCD (μEye, IDS, Obersulm, Germany) متصلة بمنفذ التصوير في المجهر. وبافتراض أن الصورة على الكاميرا متمركزة في مجال رؤية المجهر، يكون الشعاع على المحور عندما تكون البقعة البؤرية متمركزة على شريحة المجهر، ولا يؤدي تحريك العدسة الشيئية على طول المحور z إلى تغيير النقطة المركزية للشعاع غير المركز.
8. عند وضع عينة في مستوى العينة وتعريضها لضوء الليزر، يحدث تشتت رامان. ويقوم مرشح ثنائي اللون موضوع أسفل العدسة الشيئية للمجهر بفصل ضوء تشتت رامان المزاح طولياً (والفلورة) عن شعاع الإثارة، موجهاً ضوء تشتت رامان إلى المنفذ الجانبي للمجهر. وقد تم تعديل المجهر لإزالة أي عدسات في هذا المسار، بحيث يخرج ضوء الإشارة من المجهر موازياً.
9. بما أن شعاع الإشارة الخارج من المجهر أكبر من الفتحة الصافية لمستقطبات Glan-thompson، يتم استخدام تلسكوب بمعامل 0.47x مكون من عدستين ثنائيتي اللون اللالونية (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) لتقليص حجم الشعاع.
10. يتم بعد ذلك استقطاب ضوء الإشارة بواسطة مستقطب Glan-Thompson موجه بزاوية 0° بالنسبة للمحور الرأسي في إطار المختبر، ويوجه إلى مرآة ثنائية اللون حيث يتم دمجه مجدداً مع شعاع الضخ.

3. لكي تعمل البوابة الضوئية بأقصى كفاءة، يجب توخي الحذر في تحضير شعاع الضخ (شعاع كير) أيضاً.

1. يتم أولاً تكبير نبضة المضخة بمقدار 0.35x باستخدام تلسكوب مكون من عدستين مزدوجتين لابلونيتين (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm) لمطابقة الحجم النهائي لحزمة الإشارة.
2. تُرسل حزمة المضخة بعد ذلك إلى خط تأخير يتكون من منشور قائم الزاوية موضوع على منصة إزاحة خطية يمكن ضبطها لضمان التداخل الزمني لنبضات المضخة والإشارة (سيتم مناقشة الضبط أدناه).
3. بعد خط التأخير، تُمرر الحزمة عبر لوح نصف موجي ومستقطب موجه بزاوية 45° بالنسبة للمحور الرأسي في إطار المختبر، وهذا يضمن حالة الاستقطاب الصحيحة لحزمة المضخة عند وصولها إلى الوسط غير الخطي.
4. يتم بعد ذلك عكس الضوء بواسطة مرآتي توجيه، إحداهما مزودة بعناصر تحكم كهرضغطية (piezo-electric)، وتُستخدمان لضبط موضع حزمة المضخة بدقة بحيث تتداخل مكانياً مع حزمة الإشارة. يتم تحقيق هذا التداخل من خلال مراقبة حزمتي المضخة والإشارة في موقعين، أحدهما قريب والآخر بعيد عن المرآة ثنائية اللون حيث يتم دمج الحزمتين. وعن طريق استخدام مرآة التوجيه الأولى لجعل الحزمتين تتداخلان عند النقطة القريبة، والمرآة الكهرضغطية لجعل الحزمتين تتداخلان عند النقطة البعيدة، يمكن جعل حزمة المضخة متوازية تماماً مع حزمة الإشارة.
5. بمجرد دمج الحزمتين، يتم إعداد بوابة كير (Kerr gate) ونظام التجميع لزيادة الإشارة المجمعة والمقيدة زمنياً إلى أقصى حد.

4. مع دمج الشعاعين، يتم إعداد بوابة كير (Kerr gate) ونظام التجميع لزيادة الإشارة المجمعة المحددة زمنياً إلى أقصى حد.

1. يتم تمرير حزمتي الضخ والإشارة أولاً عبر مرشح ثنائي اللون (dichroic filter) بكثافة بصرية OD تبلغ 6 عند 404 nm لمنع أي ضوء إثارة متبقٍ من تحفيز تشتت رامان داخل الوسط غير الخطي.
2. يتم بعد ذلك تركيز حزمتي الضخ والإشارة بواسطة عدسة ثنائية لا لونية (f = 35 mm) داخل خلية كوفت من الكوارتز بطول مسار 1 cm تحتوي على المادة غير الخطية. ويمكن هنا استخدام أي مادة غير خطية ذات معامل انكسار غير خطي عالٍ بما يكفي (أعلى من CS₂) واستجابة زمنية قصيرة بما يكفي (<2 ps). وفي هذه التجارب، نستخدم ثاني كبريتيد الكربون، CS₂ ، الذي يمتلك معامل انكسار غير خطي n₂ = 3.1 x 10⁻¹⁸ m²/W. ثم يتم إعادة موازاة الضوء بواسطة عدسة ثنائية ثانية ذات طول بؤري مطابق للأولى.
3. تمر الحزم بعد ذلك عبر محلل غلان-تومسون (Glan-Thompson analyzer) مثبت على حامل دوار، ثم عبر مجموعة من مرشحات الامتصاص والتداخل التي تبلغ كثافتها البصرية المشتركة OD = 10 عند 808 nm.
4. أخيراً، يتم تركيز ضوء الإشارة بواسطة عدسة ثنائية لا لونية (f = 35 mm) داخل ليف بصري متعدد الأنماط بقطر 50 μm، حيث يُثبت الليف في منصة تسمح بالإزاحة في المحاور x وy وz. ثم يتم توصيل الليف بمطياف تصوير تجاري مزود بكاميرا CCD (طرازا SP2300i وPixis 100B على التوالي، وكلاهما من تصنيع شركة Princeton Instruments في Trenton, NJ).
5. لمحاذاة نظام التجميع بهدف تعظيم الإشارة المجمعة، يتم ضبط المحلل على زاوية 0° ووضع عينة اختبار من التولوين في مستوى العينة. ومن خلال ضبط عناصر التحكم x وy وz لحامل الليف، يتم تحسين إشارة رامان المجمعة.
6. لضمان التداخل المكاني والزمني الصحيح لحزمتي الضخ والإشارة، توضع مرآة في مستوى العينة للمجهر، مع إزالة مرشح 404 nm من النظام. وعند تدوير المحلل إلى زاوية 90°، يتم إرسال حزمة 404 nm المنعكسة إلى المطياف مع ضبط شدتها بحيث لا تتسبب في إشباع الكاميرا. ومع إيقاف حزمة الضخ، يتم تدوير المحلل لتقليل إشارة 404 nm النافذة إلى أدنى حد. وعند إعادة تشغيل حزمة الضخ، يتم ضبط منصة التأخير ببطء حتى تبدأ نفاذية ضوء 404 nm في الزيادة. بعد ذلك، ومن خلال الضبط التكراري لمنصة التأخير، والمرآة الكهرضغطية (piezo-electric mirror)، وعناصر التحكم x وy وz لليف، يتم الوصول إلى أقصى قدر من الإشارة.
7. بما أن حزمة 404 nm المنعكسة وضوء تشتت رامان قد يسلكان مسارين مختلفين قليلاً عبر النظام، يتم إجراء التعديلات النهائية بوضع مادة قوية لتشتت رامان (مثل التولوين) على منصة العينة، ومعايرة المحاذاة بدقة من خلال تغيير منصة التأخير، والمرآة الكهرضغطية، وعناصر التحكم x وy وz لليف لتحسين إشارة رامان.

5. يتطلب جمع طيف رامان واحد محدد زمنياً الحصول على عدة أطياف لتصحيح العيوب الاصطناعية للنظام.

1. مع ضبط المحلل عند 0°، وتشغيل شعاع الإثارة وإيقاف شعاع الضخ، يتم أخذ طيف "غير مبوب"، وهو يمثل الطيف الذي سيتم الحصول عليه دون الاستفادة من نظام التبويب الزمني.
2. مع ضبط المحلل عند 90°، مع بقاء شعاع الإثارة وشعاع الضخ في حالة إيقاف، يتم أخذ طيف خلفية، وهو يمثل كمية الضوء الشارد المتسرب عبر المستقطبات والعناصر الأخرى في النظام.
3. مع بقاء المحلل عند 90° وتشغيل جميع الأشعة، يتم أخذ الطيف "المبوب"، وهو يمثل ضوء رامان المشتت الذي سمحت المستقطبات المتقاطعة بمروره نتيجة وجود شعاع الضخ.
4. أخيراً، مع بقاء المحلل عند 90°، وإيقاف شعاع الإثارة وتشغيل شعاع الضخ، يتم أخذ طيف خلفية ثانٍ، وهو يمثل مساهمة الكميات المتبقية من ضوء 808 nm التي تدخل إلى المطياف في الطيف "المبوب".
5. بالإضافة إلى ذلك، يتم أخذ طيف مع إيقاف تشغيل جميع الليزرات، لتوصيف مستوى إشارة "الظلام" الأساسي للكاميرا والإلكترونيات.
6. نظراً لأن الأطياف غالباً ما تتطلب أزمنة تكامل طويلة، فمن الضروري تقسيم زمن التكامل هذا إلى عدة أجزاء (إطارات) للسماح بالتصحيح السليم للأشعة الكونية - وهي مشكلة شائعة عند الحصول على البيانات عبر فترات زمنية تمتد لعدة دقائق.

6. بمجرد الحصول على البيانات، تكون عدة خطوات معالجة مفيدة لتحسين جودة البيانات ومظهرها.

1. أولاً، يتم تصحيح جميع الأطياف من تيار الظلام عن طريق طرح طيف "الظلام".
2. ولتصحيح تأثير الأشعة الكونية، تتم مقارنة الإطارات المتعددة التي تشكل عملية استحواذ واحدة ببعضها البعض على أساس كل بكسل على حدة. وبالنسبة لأي بكسل في أي إطار تقع قيمته خارج نطاق انحرافين وسيطين عن القيمة الوسيطة لذلك البكسل عبر جميع الإطارات، يتم استبدال قيمة ذلك البكسل بالقيمة الوسيطة عبر جميع الإطارات.
3. بعد ذلك، يتم حساب متوسط الإطارات المصححة من الأشعة الكونية وتنعيمها باستخدام مرشح Savitzky-Golay ¹.
4. لاستخراج الطيف "البوابي" الحقيقي، نطرح أطياف "الإثارة فقط" و"المضخة فقط" من الطيف البوابي المقاس.
5. أخيراً، يتم تصحيح خلفية الأطياف البوابية وغير البوابية عن طريق طرح متعدد حدود من الدرجة الخامسة 5^th، يتم تحديده باستخدام طريقة Lieber و Mahadevan-Jansen ².

7. النتائج النموذجية:

الشكل 1. مخطط تخطيطي لنظام بوابات كير (Kerr gating). يظهر مسار شعاع الضخ باللون الأحمر، بينما يظهر مسار توليد التوافقي الثاني (SHG) باللون الأزرق. ويظهر المسار الذي يتداخل فيه رامان والفلورة باللون الأخضر، بينما يظهر المسار الذي تمت فيه تصفية الفلورة زمنياً باللون الأصفر. الاختصارات كما يلي: BPF، مرشح تمرير نطاقي؛ CCD، جهاز اقتران شحني؛ DCM، مرآة ثنائية اللون؛ FI، عازل فاراداي؛ λ/2، لوحة نصف موجية؛ LPF، مرشح تمرير طويل؛ NLM، وسط غير خطي؛ P، مستقطب؛ SHG، بلورة توليد التوافقي الثاني.

الشكل 2. الأعلى: الأطياف الخام للكومارين المذاب في زيت الغمر. يمثل المنحنى الأحمر الطيف الذي تم التقاطه مع بقاء البوابة مفتوحة (تم ضبط المحلل لتحقيق أقصى قدر من النفاذية). ويمثل المنحنى الأسود الطيف الذي تم التقاطه مع ضبط المحلل لتحقيق أدنى قدر من النفاذية وتطبيق شعاع الضخ (الطيف المعتمد على البوابة). ويمثل المنحنى الأزرق الطيف الذي تم التقاطه مع ضبط المحلل لتحقيق أدنى قدر من النفاذية وعدم تطبيق شعاع الضخ (البوابة مغلقة). ويمثل المنحنى الأخضر الطيف الذي تم التقاطه عند تطبيق شعاع الضخ فقط. تشير الخطوط المتقطعة باللون الأرجواني إلى المنطقة الطيفية الموضحة في اللوحة أدناه. تم تنعيم جميع الأطياف باستخدام مرشح Savitzky-Golay من الدرجة الثالثة وبـ 11 نقطة. الأسفل: أطياف الكومارين المذاب في زيت الغمر بعد طرح خلفية الفلورة. يمثل المنحنى الأحمر الطيف مع بقاء البوابة مفتوحة، والمنحنى الأزرق يمثل الطيف المعتمد على البوابة. يظهر الطيف المعتمد على البوابة بوضوح قمة العدد الموجي العالي الملتفة والمميزة للزيوت.

المناقشة

شهد مجال مطيافية رامان الطبية الحيوية اهتماماً متزايداً على مدى السنوات الماضية نتيجة لإمكانياتها المثبتة في حل العديد من التحديات الصعبة في التشخيصات البيولوجية. فعلى سبيل المثال، أظهرت أطياف رامان قيمة تشخيصية في الكشف عن السرطان ^{3, 4, 5, 6}. كما استُخدمت مطيافية رامان في التحديد الكمي للبكتيريا ^{7, 8} وفي دراسة استجابة البكتيريا للأدوية ⁹. وقد وجدت تطبيقاتها أيضاً في مجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية الأخرى التي تتراوح من صحة العظام ¹⁰ إلى تحليل السوائل الحيوية ^{11, ...}

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
العدسات	Thorlabs Inc.	متنوعة	جميع العدسات مطلية بحيث لا تتجاوز خسائر النفاذية القصوى 1% لكل منها
ليزر Ti:Sapph قابل للضبط	Coherent Inc.	Chameleon	30 nJ, 200 fs, 80 MHz
عدسة شيئية غمر زيتي 40X	Olympus Corporation	UApo/340	NA = 1.35
مجهر مقلوب	Olympus Corporation	IX-71	معدل لإزالة جميع العدسات في المنفذ الجانبي
لوح نصف موجي	Thorlabs Inc.	AHWP05M-600
مستقطب Glan-Thompson	Thorlabs Inc.	GTH10M	خسارة نفاذية ∼10%
مطياف	Princeton Instruments/Acton	SP2300i
كاميرا CCD	Princeton Instruments/Acton	Pixis 100B
برمجيات رياضية	Mathworks	MATLAB	الإصدار 2008a
عازل فاراداي	EOT	BB8-5I
مرآة كهرضغطية	Newport Corp.	AG-M100
بلورة BBO	CASIX	مخصصة	سُمك 1 mm
مرشح تمرير نطاق 1	Andover	008FC14	808 ± 0.4 nm
مرآة ثنائية اللون	Semrock	FF662-FDI01	حافة النطاق عند 662 nm
مرشح تمرير طويل	Semrock	BLP01-405R	حافة النطاق عند 417 nm
مرشح تمرير نطاق 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 nm
CS2	Sigma-Aldrich	335266	نقاء 99%
كومارين 30	Sigma-Aldrich	546127	نقاء 99%
زيت غمر	Cargill Labs	16242	نوع DF