يوضح هذا الفيديو طريقة تستفيد من الجمع بين التثقيب الكهربائي والمجهر البؤري لإجراء تصوير حي لخلايا عصبية سلفية فردية في الدماغ الأمامي لسمكة الزيبرا النامية. ويمكن من خلال هذه الطريقة إجراء تحليل In vivo لتطور الخلايا العصبية السلفية في الدماغ الأمامي على مستوى استنساخي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد الأنماط الدقيقة لانقسام وهجرة وتمايز الخلايا السلفية العصبية ضرورية لنمو الدماغ ووظيفته بشكل سليم1,2. ولفهم سلوك الخلايا السلفية العصبية في البيئة المعقدة in vivo، هناك حاجة ماسة للتصوير الحي بنظام المراقبة الزمنية (time-lapse) لهذه الخلايا في دماغ سليم. في هذا الفيديو، نستغل الخصائص الفريدة لأجنة سمك الزيبرا لتصوير تطور الخلايا السلفية العصبية في الدماغ الأمامي in vivo. نستخدم التثقيب الكهربائي (electroporation) لوسم الخلايا السلفية العصبية الفردية وراثياً وبكثافة منخفضة. وباختصار، تم حقن تراكيب DNA تشفر لعلامات فلورية في بطين الدماغ الأمامي لأجنة سمك الزيبرا بعد 22 ساعة من الإخصاب (hpf)، ثم تم إلقاء نبضات كهربائية فوراً. وبعد ست ساعات، تم تثبيت أجنة سمك الزيبرا التي خضعت للتثقيب الكهربائي باستخدام أغاروز منخفض درجة الانصهار في أطباق زراعة ذات قاعدة زجاجية. ثم تم تصوير الخلايا السلفية العصبية الموُسمة فلورياً لمدة 36 ساعة على فترات زمنية ثابتة باستخدام مجهر كونفوكالي مزود بعدسة غمر مائية. توفر هذه الطريقة وسيلة لاكتساب رؤى حول تطور الخلايا السلفية العصبية في الدماغ الأمامي in vivo، ويمكن تطبيقها على أجزاء أخرى من الجهاز العصبي المركزي لجنين سمك الزيبرا.
البروتوكول
1. تحضير أجنة سمك الزيبرا
- قبل يومين من عملية التثقيب الكهربائي، قم بتجهيز أقفاص تزاوج لأسماك من النوع البري باستخدام فواصل لعزل الذكور عن الإناث.
- قبل يوم واحد من عملية التثقيب الكهربائي، قم بإزالة الفواصل من أقفاص التزاوج التي تم تجهيزها في اليوم السابق.
- اجمع الأجنة وقم بتحضين 50 جنيناً مخصباً في 30 ml من الوسط الجنيني الذي يحتوي على 0.003% من مادة phenylthiourea (PTU) عند درجة حرارة 28.5°C.
- في يوم التثقيب الكهربائي، قم بإزالة الغشاء الكوريوني للأجنة يدوياً باستخدام ملاقط دقيقة (Inox 5, Dumont Electronic, Switzerland) عندما تصل الأجنة إلى المرحلة التنموية 22hpf. ثم انقل الأجنة إلى 10ml من محلول رينجر الخاص بالتثقيب الكهربائي3 (180 mM NaCl, 5mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM Hepes pH 7.2) والذي يحتوي على 0.003% PTU.
- أضف 420 μl من محلول تريكاين المركز (4mg/ml) إلى الـ 10ml من محلول رينجر الخاص بالتثقيب الكهربائي لتخدير الأجنة.
2. التحضير للتثقيب الكهربائي
- تم سحب إبر الحقن الزجاجية من الشعيرات (القطر الخارجي 1.2 mm، والقطر الداخلي 0.9 mm، مع خيط سحب) باستخدام جهاز سحب Flaming-Brown P897 (Sutter Instruments, Novato, CA, USA). تم كسر طرف الإبرة باستخدام ملقط للحصول على نهاية حادة كما هو موضح في الشكل 1D. يجب أن يكون قطر الطرف حوالي 10 μm وزاوية الاستدقاق حوالي 30 degree.
- قم بتحضير أغاروز منخفض درجة الانصهار بتركيز 0.8% و 1% (Shelton Scientific, Inc. كتالوج #IB70050) في محلول رينجر الخاص بالتثقيب الكهربائي. قم بتقسيم محلول الأغاروز إلى أجزاء في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 ml. احفظ هذه الأجزاء في كتلة تسخين عند درجة حرارة ~37°C.
- يُستخدم نظام Gal4/UAS لتحفيز التعبير الجيني في الخلايا السليفة العصبية للأجنة التي خضعت للتثقيب الكهربائي. يتم استخدام بلازميدين: البلازميد EF1α-GFF-PT2KXIG، حيث يتم تحفيز Gal4FF بواسطة المحفز الشامل EF1α، والبلازميد UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG.
- قم بتحضير الحمض النووي للبلازميدين EF1α-GFF-PT2KXIG و UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG باستخدام مجموعة GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit (Sigma).
- يتم بعد ذلك تركيز البلازميدات عن طريق الترسيب باستخدام أسيتات الصوديوم/الإيثانول حتى يصل التركيز النهائي إلى 1-2 μg/μl في محلول 10 mM Tris·Cl (PH 8.5).
- امزج البلازميدين وقم بالتخفيف باستخدام H2O خالي من النيوكلياز ليصل التركيز النهائي إلى 500 ng/μl لكل بلازميد. يُفضل إضافة الفينول الأحمر (مخفف بنسبة 1/10 من الحجم الكلي) إلى المحلول لتسهيل رؤية عملية التوصيل. احفظ محلول DNA على الثلج.
- قبيل عملية التثقيب الكهربائي مباشرةً، قم بتعبئة إبرة الحقن من الخلف بـ 2 μl من محلول DNA واضبط حجم الحقن على 2 nl.
3. التثقيب الكهربائي
- يتم إعداد مجهر تشريح ستيريو (Zeiss Stemi 2000 بتكبير أقصى يصل إلى 50x)، وحاقن بضغط الهواء (Narishige IM 300 microinjector)، وجهازي تلاعب مجهري (WPI M3301R, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)، ومحفز كهربائي (SD9 square pulse stimulator, Grass Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) كما هو موضح في الشكل 1A.
- لتثبيت الأجنة، اغمر جنينين في أغاروز منخفض درجة الانصهار بتركيز 1%. ثم أخرج الأجنة فوراً من الأغاروز باستخدام ماصة زجاجية.
- ضع الأجنة على غطاء طبق بتري بلاستيكي مقلوب في قطرات فردية من الأغاروز. وجه الأجنة بلطف باستخدام مسبار ليفي لتكون في وضعية الظهر للأعلى قبل أن يتصلب الأغاروز، بحيث يكون الدماغ الأمامي متاحاً لكل من الأقطاب الكهربائية وإبرة الحقن المجهري (الشكل 1B). يجب تثبيت الأجنة في قطرات أغاروز فردية.
- تحكم في الأقطاب الكهربائية باستخدام جهاز التلاعب المجهري الأيسر. أدخل الأقطاب الكهربائية في الأغاروز كما هو موضح في الشكل 1B. تُستخدم أقطاب ثنائية القطب متوازية مخصصة من البلاتين والإريديوم بقطر 125 μm ومسافة فاصلة 500 μm لعملية التثقيب الكهربائي (FHC, catalog #PBSA0575).
- أدخل إبرة الحقن المجهري في بطين الدماغ الأمامي واحقن 4nl من خليط DNA، حيث يمكن ملاحظة تدفق سائل أحمر وانتفاخ البطين.
- فوراً، يتم تطبيق نبضة واحدة بجهد 28.5 V لمدة 1 millisecond يدوياً. ثم اعكس القطبية وطبق نبضة أخرى بجهد 28.5 V لمدة 1 millisecond. سيؤدي ذلك إلى وسم فسيفسائي ثنائي الجانب للخلايا السلفية العصبية في الدماغ الأمامي.
- بعد التثقيب الكهربائي لـ 10 أجنة، أضف 5ml من الوسط الجنيني لتغطية الأجنة وقم بتقشير الأغاروز باستخدام سكين جراحي مجهري لتحرير الأجنة.
- انقل الأجنة التي خضعت للتثقيب الكهربائي إلى طبق جديد يحتوي على 30 ml من الوسط الجنيني الذي يحتوي على 0.003% PTU واحضنها عند درجة حرارة 28.5°C.
4. التثبيت والتصوير الحي بنظام الفاصل الزمني
- بعد حوالي 4 ساعات من التثقيب الكهربائي، يمكن ملاحظة إشارة EGFP عند الفحص باستخدام مجهر تشريح إبيفلوروسنتي.
- بعد خمس ساعات من التثقيب الكهربائي، يتم اختيار الأجنة التي تظهر تعبيراً قوياً لـ EGFP ولكن بنمط موزاييكي عالٍ في منطقة الدماغ الأمامي.
- انقل الأجنة المختارة إلى 10ml من الوسط الجنيني الذي يحتوي على 0.003% PTU.
- أضف 420 μl من محلول التريكاين المركز (4mg/ml) إلى 10ml من الوسط الجنيني لتخدير الأجنة.
- لتثبيت الأجنة، اغمر جنيناً واحداً في Agarose بنسبة 0.8% منخفض درجة الانصهار. ثم أخرج الجنين فوراً من الـ agarose باستخدام ماصة زجاجية وضعه في مركز طبق زرع زجاجي القاع بقطر 35mm (شركة MatTek، رقم القطعة P35GC-1.5-10-C، www.glass-bottom-dishes.com).
- وجه الأجنة برفق باستخدام مسبار ليفي لتكون في وضعية الظهر للأعلى قبل أن يتصلب الـ agarose.
- ضع الطبق بشكل صحيح على المنصة التي يتم التحكم في درجة حرارتها في المجهر البؤري كما هو موضح في الشكل 1C (نستخدم مجهر Nikon C1 spectral confocal بمجموعة عدسات عمودية). اضبط درجة الحرارة على 28.5°C.
- أضف 3ml من الوسط الجنيني المسخن مسبقاً لدرجة 28.5°C والذي يحتوي على 0.003% PTU لتغطية الجنين. أصبح الجنين الآن جاهزاً للتصوير.
- أجرِ تصويراً حياً بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) بفاصل ثابت باستخدام عدسة غمر مائية.
5. النتائج الممثلة
تظهر في الشكل 2 إطارات مختارة من تصوير حي متسارع الزمن بمجهر كونفوكال للجنين الذي خضع لعملية تثقيب كهربائي بـ EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP عند 22 hpf.
الشكل 1. إعداد الجهاز. (أ) مجموعة معدات التثقيب الكهربائي: محفز النبض المربع Grass SD9 (i)، والمناور الدقيق الأيسر (ii)، والأقطاب الكهربائية (iii)، والمجهر التشريحي Zeiss (iv)، وإبرة الحقن (v)، والمناور الدقيق الأيمن (vi)، والحاقن الدقيق Narishige IM 300 (vii). (ب) الموضع النسبي للأقطاب الكهربائية (i)، وبطين الدماغ الأمامي (ii)، وإبرة الحقن (iii). يلاحظ أنه تم حقن محلول DNA الملون باللون الأحمر في بطين الدماغ الأمامي. (ج) تجميع التصوير الحي على مجهر Nikon C1 confocal: وحدة التحكم في درجة الحرارة (i)، وعدسة الشيئية الغاطسة في الماء (ii)، والجنين الذي خضع للتثقيب الكهربائي والمضمن في أغاروز منخفض درجة الانصهار في طبق زراعة ذو قاع زجاجي (iii). (د) صورة لإبرة مسحوبة ومقطوعة مخصصة للحقن الدقيق لـ DNA.
الشكل 2. لقطات مختارة من تصوير حي تزامني بفاصل زمني لمدة 18 ساعة باستخدام المجهر البؤري لجنين تم إجراء التثقيب الكهربائي له بـ EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP عند 22 hpf. يقع سطح البطين في الجانب السفلي من كل إطار صورة. يمثل شريط المقياس 10 μm.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نوضح في هذا الفيديو طريقة للتصوير الحي بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) للخلايا السلفية العصبية على المستوى النسلي في الدماغ الأمامي لسمكة الزيبرا النامية. لقد قمنا باختبار وتعديل بروتوكولات التثقيب الكهربائي (electroporation) الحالية4-6 لوسم الخلايا السلفية العصبية الفردية جينياً وبلون فلوري. ويمكن إنشاء شجرة سلالة مكونة من خلايا بنوية ذات صلة نسلية نظراً لأن عدداً قليلاً فقط من الخلايا قد وُسم بشكل متباعد باستخدام جهد كهربائي منخفض نسبياً في عملية التثقيب الكهربائي. وبالإضافة إلى EGFP، يمكن وسم الخلايا السلف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH رقم NS042626. نتوجه بالشكر إلى Kurt Thorn ومركز UCSF Nikon Imaging للمساعدة في التصوير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المراجع
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- G#246;tz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).
- Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos. Methods. 39, 207-211 (2006).
- Hendricks, M., Jesuthasan, S. Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development. Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).
- Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration. Genesis. 32, 27-31 (2002).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
