حقن الدم الذاتي نموذج نزيف داخل المخ في الفئران الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم تقنية الحقن المزدوج لتقليل خطر ارتداد الدم تصل المسار الإبرة ، أي مضادات التخثر في نظام الضخ ، ويزيل كل المساحة الميتة والأنابيب القابلة للتوسيع في النظام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حقن الدم ذاتي النزيف الدماغي الداخلي النموذجي لالعفوي في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتطلب استقصاء الفيزيولوجيا المرضية للإصابة بعد النزيف داخل الدماغ (ICH) نموذجاً حيوانياً قابلاً للتكرار. ورغم أن النزيف داخل الدماغ يشكل 10-15% من إجمالي السكتات الدماغية، إلا أنه لا يوجد حتى الآن علاج فعال ومحدد. يتضمن نموذج حقن الدم الذاتي في الفئران الحقن بالتوجيه التجسيمي للدم الشرياني في العقد القاعدية لمحاكاة النزيف الناتج عن ارتفاع ضغط الدم التلقائي لدى البشر. ويمكن بعد ذلك دراسة الاستجابة للنزيف داخل الجسم الحي وقياس العجز السلوكي العصبي، مما يسمح بوصف الاعتلالات اللاحقة واختبار العوامل العلاجية المحتملة. يستخدم الإجراء الموصوف في هذا البروتوكول تقنية الحقن المزدوج لتقليل خطر ارتداد الدم عبر مسار الإبرة، مع عدم استخدام مضادات التخثر في نظام الضخ، كما يلغي جميع المساحات الميتة والأنابيب القابلة للتمدد في النظام.
البروتوكول
1. إعداد التجهيزات
- مسح أسفل الإطار التجسيمي ومضخة الإيثانول مع 75 ٪ للحد من التلوث الجرثومي.
- هاميلتون تعقيم المحاقن والإبر تنصهر السيليكا.
ملاحظة : إذا تم استخدام التعقيم الكيميائي ، يجب التأكد من شطف عدة مرات في ماء معقم قبل الاستعمال. - يمسح سطح الورقة شمع البارافين مع الايثانول 75 ٪ والسماح ليجف.
2. إعداد الماوس للحقن
ملاحظة : هل الفئران تسليمها إلى مرفق حيوانك 7 أيام على الأقل قبل الجراحة للسماح لهم للتأقلم مع البيئة الجديدة والحد من التوتر.
- وزن الماوس قبل العملية الأساسية.
- تحريض التخدير مع الأوكسجين 30 ٪ ، وأكسيد النيتروز بنسبة 70 ٪ و 4 ٪ لا تستجيب حتى Isoflurane لقرصة الذيل
- حقن الفأر مع البوبرينورفين 0.1mg/kg intraperitoneally لتسكين بعد العملية الجراحية
- حلق الرأس
- عيون معطف مع الفازلين المعقم
- إعداد مسح فروة الرأس مع betadine 3 × ، والسماح لتجف ثم فروة الرأس
- جعل 1 سم الشق السهمي خط الوسط من فروة الرأس باستخدام مشرط الجراحة المعقمة
ملاحظة : هناك شق سخية تسمح التعرض كاملة من معالم الجمجمة. - حلق 1 سم من السطح البطني الذيل التي تبدأ في 1 سم من القاعدة والتحضير مع betadine × 3 مناديل
- مكان الماوس على الإطار التجسيمي
ملاحظة : من المهم لضمان تأمين الماوس في الإطار مع سطح مواز مع قاعدة الجمجمة من الإطار ، مع التعرض ممتازة وbregma لا يقل عن 3 ملم على يمين bregma.
3. نزف داخل المخ لعملية جراحية
ملاحظات : خلال جراحة كامل الفأر هو تخدير مع الأوكسجين 30 ٪ ، وأكسيد النيتروز بنسبة 70 ٪ ، وIsoflurane 1-3 ٪ ، حافظت باستمرار عند 37 ± 0.5 درجة مئوية باستخدام الثرمستور التي تسيطر عليها سادة التدفئة ومراقبتها بواسطة ترمومتر المستقيم.
- إبرة معقمة نعلق على 27 غ من حقنة سم مكعب 1 في الإطار.
- ضبط ذراع التجسيمي حتى الإبرة هو بالضبط مدى bregma.
- ضبط ذراع بحيث الإبرة في +2.5 ملم الجانبي لbregma والسفلى لسطح الجمجمة.
- تدوير المحاقن يدويا لجعل ثقب لدغ على سطح الجمجمة أثناء تطبيق الحركة الهبوطية لطيف من الإطار مع الحرص على عدم ثقب الجمجمة تماما.
- إزالة الإبرة ، وثقب لدغ كاملة يدويا مع حقنة / إبرة
ملاحظة : إكمال لدغ حفرة باليد يسمح للاعتراف الفوري عندما يكون لديك مثقبة الجدول الداخلي من الجمجمة ويقلل خطر من دون قصد دفع الإبرة في حمة الدماغ. - جعل شق عرضي على السطح البطني الذيل باستخدام شفرة جراحية معقمة ، والسماح 2-3 قطرات كبيرة من الدم الشرياني أن أسقط ورقة شمع البارافين. ثم وقف النزيف بسرعة مع الضغط باستخدام شاش معقم.
- سحب الدم 17 ميكرولتر الى حقنة حقنة هاميلتون ومكان على المضخة.
- ضبط ذراع التجسيمي إلى نقطة من 5 درجات النسبية إعلامي لمحور عمودي.
- ضبط دقيق بحيث الذراع التجسيمي رأس الإبرة هو أكثر من ثقب في الجمجمة ولدغ ثم انخفاض إبرة 3.5 ملم.
- 2 انتظر دقيقة ثم سحب الإبرة 0.5 ملم (بحيث غيض هو 3 ملم العميق)
- انتظر 5 دقائق للسماح للدماغ حول إبرة إعادة توسيع وتقليل المخاطر من الدم refluxing يصل المسار الإدراج خلال إبرة الحقن.
- لضخ دماء 1 ميكرولتر / دقيقة 7.5 ميكرولتر.
- انتظر 5 دقائق للسماح للتخثر الدم الأولي والأنسجة تحدث تحولات للحد من ارتفاع في الضغط داخل الجمجمة.
- ضخ ما تبقى من 7.5 ميكرولتر في 1 ميكرولتر / دقيقة
- إبرة تسمح لتبقى في مكانها لمدة 25 دقيقة للسماح لتخثر الدم
ملاحظة : عدم انتظار نتيجة تخثر الدم في الدم سوف يصل refluxing موقع إبرة عندما سحب الإبرة - تسحب الإبرة ببطء وشطف مع الماء الساخن على الفور لمنع أي الدم المتبقي في الإبرة من التخثر ، وضمان إعادة استخدام الإبرة.
- إزالة الماوس من الإطار وإغلاق الشقوق الذيل وفروة الرأس مع الغراء الجراحية البيطرية.
- إيقاف التخدير.
- السماح الماوس لتوقظ في حين يجري باستمرار مع تحسنت حرية الحصول على الغذاء مبلل.
- عودة إلى قفص مع الماوس عندما تتزاحم مستيقظا تماما. مكان رطب بيليه الغذائية على الجزء السفلي من القفص لمساعدة الحيوانات في الحصول على الغذاء.
4. ممثل النتائج :
الشكل 1. الاكليل الجزء من الدماغ الماوس 15 دقيقة بعد عملية جراحية ICH. التضحية فورا بعد تفتيشه من الدماغ للنجاح ICH على أساس التفتيش الجسيمة لقسم الاكليلية في موقع إبرة الإدراج. واعتبرت أن نزيف تعقبها وصولا الى قاعدة الدماغ ، بزيادة المسار الإبرة الماضي الجسم الثفني ، أو في البطينين ناجحة وأنه تم القضاء على الماوس من كل التحليلات. عموما ICH succeوكانت معدلات SS 75-85 ٪ في 50 مع معدل وفيات الفئران 0 ٪.
الشكل 2. اسطوانة اختبار يوضح فالج غادر مباشرة بعد ICH العقد القاعدية. (أ) الخلفية الفأر نموذج ICH بعد الجراحة. لاحظ موضع forelimb فقط الحق على جدار الاسطوانة بعد أن غادر ICH العقد القاعدية. (ب) رسم بياني لنتائج اختبار اسطوانة 1 من فوج من الفئران بعد ICH عملية جراحية (ن = 5) مقارنة زائفة (ن = 4). وكان خدعة الفئران جميع الإجراءات عدا حقن الدم (تم إدراج إبرة في الدماغ). وضعت الماوس في كل أسطوانة قطرها 12 سم ، والزجاج واضحة ، ولاحظ لمدة 20 المؤخرات. وسجل الموضع الأولي للالأمامية على جدار الاسطوانة في الخلفية. لم تكن الحركات وسجل لاحقة (مثل التنقيب الوحشي) حتى الماوس عاد إلى الأرض وسجل العمق المقبل. تم حساب المؤشر وتجانب (مواضع # forelimb على الجانب الأيمن من الاسطوانة -- غادر # المواضع forelimb) / (يمين # + # # + اليسار على حد سواء) ، حيث 0 لا تشير إلى تفضيل forelimb و 1 أشارت كانت تستخدم فقط في حق forelimb .
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا النموذج من نزيف داخل المخ جراحية في الفئران باستخدام ذاتي النتائج الدم في الشريان الذيل نموذجا استنساخه من النزف العفوي العقد القاعدية. نموذج ICH في الفئران تقدم ميزة توافر الحيوانات المعدلة وراثيا للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية ، ولكن صغر حجمها يجعل إجراءات جراحة الأعصاب أكثر صعوبة من الناحية الفنية في جو من الحيوانات.
نموذج كولاجيناز وحقن الدم نموذج ذاتي هما راسخة نماذج من التراث الثقافي غير المادي التجريب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وتم تمويل العمل على زمالة من معهد للطب والعلاج بالحركة ، ومنحة تدريبية من معهد للطب والهندسة (T32HL007954) في جامعة ولاية بنسلفانيا ولام كوهين مارلين وجيروم H. Fleisch منح الباحث في جامعة كونيتيكت مركز صحي (LHS) ، والمعاهد الوطنية للصحة NS - 029331 (فاو).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
التجسيمي الإطار لجراحة الأعصاب الماوس (Stoelting ، 51925)
مضخة Microinfusion والمعالج (UMP - 3 وMicro4 ، الآلات الدقيقة العالمي ، ساراسوتا ، فلوريدا)
الماوس دفئا (Stoelting ، 50300)
الاستنشاق التخدير الماوس (برينتري العلمية وEZ - AF9000)
25 ميكرولتر gastight حقنة هاميلتون البورسليكات مع المكبس المطلي وإبرة لا
(هاملتون شركة رينو ، نيفادا ، 1702RN حقنة : 765401 ، الطويق : 30949 ، هل : 30946)
إبرة قطع تنصهر السيليكا على طول سم 2 (هاملتون ، 17739)
ويمكن إعادة استخدامها * لاحظ هاملتون المحاقن والإبر تنصهر السيليكا الخضوع لعمليات جراحية متعددة إذا تعقيمها قبل كل عملية جراحية. هذه المواد ضرورية لتجنب تجلط الدم.
الجراحية القفازات المعقمة
ثوب الجراحية ، وغطاء المحرك وقناع
Betadine
75 ٪ من الإيثانول
إبرة معقمة 27 ز (استخدام مرة واحدة)
المحاقن المعقمة سم مكعب 1 (استخدام مرة واحدة)
شفرة جراحية معقمة
Cidex
المياه المعقمة
البوبرينورفين وisoflurane
شاش معقم
الساحات البارافين الشمع ورقة
الجراحة البيطرية الغراء (Vetbond ، 3M ، وسانت بول ، مينيسوتا)
المراجع
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
