مقالة منهجية

الحساسية العالية 5 - hydroxymethylcytosine كشفها في أنسجة المخ BALB / C

17.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/2661

⸱

فبراير 1, 2011

 , 
1Applications and Product Development, New England Biolabs

في هذه المقالة

ملخص

يمكن استخدام EpiMark 5 - 5 - مؤسسة حمد الطبية وأدوات التحليل MC لتحليل وquantitate methylcytosine 5 و 5 hydroxymethylcytosine داخل موضعا cific جمعية مهندسي البترول. عدة يميز MC - 5 - 5 من مؤسسة حمد الطبية عن طريق إضافة السكر إلى مجموعة الهيدروكسيل من HMC - 5 عبر رد فعل الأنزيمية باستخدام β - ناقلة الغلوكوزيل (T4 - BGT). عند 5 - HMC يحدث في سياق CCGG ، يحول هذا التعديل MspI شطورة موقع إلى موقع غير شطورة.

الملخص

تُعد عملية إضافة مجموعة الهيدروكسي ميثيل إلى الحمض النووي (DNA hydroxymethylation) تعديلاً معروفاً منذ فترة طويلة في الحمض النووي، ولكنها أصبحت مؤخراً محوراً للبحث في علم التخلق (epigenetic research). ويخضع الحمض النووي للثدييات لتعديل إنزيمي عند الموقع 5يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته. موضع الكربون لبقايا السيتوزين (C) إلى 5-mC، وبشكل رئيسي في سياق ثنائيات النوكليوتيد CpG. وتكون 5-mC قابلة للأكسدة الإنزيمية إلى 5-hmC بواسطة عائلة إنزيمات Tet، والتي يُعتقد أنها تشارك في عمليات النمو والمرض. وفي الوقت الحالي، ليس الدور البيولوجي لـ 5-hmC مفهوماً بشكل كامل، ولكنه يثير الكثير من الاهتمام نظراً لإمكانية استخدامه كعلامة بيولوجية. ويعود ذلك إلى عدة دراسات رائدة حددت وجود 5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين في الخلايا الجذعية الجنينية (ES) والخلايا العصبية للفئران.

تعجز تقنيات البحث، بما في ذلك طرق تسلسل البيسلفيت، عن التمييز بسهولة بين 5-mC و 5-hmC . وتوجد بعض البروتوكولات التي يمكنها قياس الكميات الإجمالية لـ 5-hydroxymethylcytosine في الجينوم، بما في ذلك تحليل الكروماتوغرافيا السائلة المقترنة بمطياف الكتلة أو كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة للنوكليوسيدات المفردة المهضومة من الحمض النووي الجينومي. كما توجد أجسام مضادة تستهدف 5-hydroxymethylcytosine، والتي يمكن استخدامها في تحليل لطخة النقطة، أو التألق المناعي، أو ترسيب الحمض النووي المهدروكسي ميثيلي، ولكن هذه الأجسام المضادة لا تملك دقة تمييز على مستوى القاعدة الواحدة. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد دقة التمييز على حجم الحمض النووي المترسب مناعيًا، وفي تجارب المصفوفات الدقيقة، تعتمد على تصميم المسبار. وبما أنه من غير المعروف بدقة أين يوجد 5-hydroxymethylcytosine في الجينوم أو دوره في التنظيم فوق الجيني، فإن هناك حاجة إلى تقنيات جديدة يمكنها تحديد الهيدروكسي ميثيلية الخاصة بمواقع محددة. ويوفر طقم تحليل EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit حلاً للتمييز بين هذين التعديلين في مواقع محددة.

تُعد مجموعة تحليل EpiMark 5-hmC and 5-mC طريقة بسيطة وقوية لتحديد وقياس كمية 5-methylcytosine و 5-hydroxymethylcytosine ضمن موقع محدد من الحمض النووي DNA. يعتمد هذا النهج الإنزيمي على الحساسية التفاضلية للمثيلة للإنزيمات المتماثلة في القطع MspI و HpaII من خلال بروتوكول بسيط يتكون من 3 خطوات.

تتم معالجة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) الجينومي المستهدف باستخدام T4-BGT، مما يضيف مجموعة جلوكوز إلى 5-hydroxymethylcytosine. هذا التفاعل لا يعتمد على التسلسل، وبالتالي سيتم جلوكزة جميع 5-hmC؛ بينما لن يتأثر الـ DNA غير المعدل أو الذي يحتوي على 5-mC.

تلي عملية الغلكوزة هذه عملية هضم باستخدام إنزيمات القطع التقييدية. يتعرف كل من MspI و HpaII على التسلسل نفسه (CCGG)، لكنهما يتأثران بحالات ميثيلية مختلفة. يقوم HpaII بقطع الموقع غير المعدل تماماً فقط: حيث أن أي تعديل (5-mC أو 5-hmC أو 5-ghmC) في أي من قواعد السيتوزين يمنع عملية القطع. أما MspI فيتعرف على 5-mC و 5-hmC ويقوم بقطعهما، ولكنه لا يقطع 5-ghmC.

يتمثل الجزء الثالث من البروتوكول في استجواب الموضع بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يمكن استخدام كمية ضئيلة من الحمض النووي المدخل تصل إلى 20 ng. يتم إجراء تضخيم للحمض النووي المستهدف التجريبي (المُجلكوز والمُهضم) والضابط (المُهضم الذي خضع لعملية جلكزة وهمية) باستخدام بادئات تحيط بموقع CCGG ذي أهمية (100-200 bp). إذا كان موقع CpG يحتوي على 5-hydroxymethylcytosine، فسيتم اكتشاف حزمة بعد الجلكزة والهضم، ولكن ليس في تفاعل التحكم غير المُجلكوز. سيعطي تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real time PCR) تقديراً لكمية hydroxymethylcytosine الموجودة في هذا الموقع المحدد.

في هذه التجربة، سنقوم بتحليل كمية 5-hydroxymethylcytosine في عينة من دماغ فأر Babl/C باستخدام تقنية end point PCR.

البروتوكول

1. Glucosylation الحمض النووي ومراقبة ردود الفعل

  1. في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر على الجليد ، مزيج 50-10 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني (لتركيز النهائي 30 ميكروغرام / ملليلتر) ، 12.4 microliters من UDP - الجلوكوز (لتركيز النهائي من 80 micromolar) ، و 31 من microliters NEBuffer 4 وتصل إلى 310 microliters nuclease خالية من المياه لتحقيق الحجم الكلي إلى 310 microliters.
  2. تقسيم هذا الخليط التفاعل إلى أنبوبين من 155 microliters لكل منهما.
  3. ثم إضافة 30 وحدة ، أو microliters 3 من T4 - ناقلة الغلوكوزيل - β لأنبوب واحد. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. الأنبوب الثاني هو رد فعل السيطرة ، إضافة لذلك microliters 3 من المياه ، بدلا من BGT - T4.
  4. احتضان كل من أنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 18 ساعة ، وخلال الوقت الذي T4 - BGT سيضيف الجلوكوز إلى مجموعة الهيدروكسيل من 5 hydroxymethylcytosine المجموعات في العينة.

2. تقييد انزيم الهضم

  1. التسمية three - PCR 0.2 ملليلتر الشريط الأرقام من 1 إلى 3 أنابيب. قسامة 50 من المجاهدين في كل خليط التفاعل.
  2. التسمية three - PCR 0.2 ملليلتر الشريط أعداد أنابيب من 4 إلى 6. قسامة 50 ماي من خليط التحكم في كل منها.
  3. إضافة 100 وحدة ، أو ميكروليتر 1 من MspI في أنابيب 1 و 4. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
  4. إضافة 50 وحدة ، أو ميكروليتر 1 من HpaII في أنابيب 2 و 5. مزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
  5. لا تضيف شيئا إلى أنابيب 3 و 6 ، كما هي الضوابط.
  6. احتضان جميع أنابيب 6 إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
  7. إضافة 1 ميكروليتر من بروتين كاف في كل أنبوب واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. تثبيط بروتين التي يحتضنها K في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.

3. تحليل الحمض النووي عن طريق PCR / qPCR

يستخدم هذا البروتوكول في NEB LongAmp طق لنقطة النهاية PCR وهو ما ثبت لأداء جيدا. يمكن أن تكون بديلا غيرها من البروتوكولات PCR.

  1. إضافة المكونات التالية لأنبوب 0.2 ملليلتر تفاعل PCR على الجليد : 10 microliters من 5X LongAmp الاحتياطي الرد طق ، 1.5 microliters من 10 dNTPs millimolar ، 1 ميكروليتر التمهيدي من 10 انتقل micromolar ، 1 ميكروليتر من 10 عكس micromolar التمهيدي و 3 من قالب microliters الحمض النووي من الخطوات السابقة ، 1 ميكروليتر من البلمرة DNA LongAmp طق ، وخالية من المياه nuclease تصل إلى 50 microliters. قد تتغير هذه الكميات وفقا لبروتوكول PCR المستخدمة.
  2. المزيج بلطف التفاعل. إذا لزم الأمر ، وجمع كل السائل إلى أسفل الأنبوب التي تدور بسرعة.
  3. تراكب العينة مع الزيوت المعدنية في حالة استخدام thermocycler دون غطاء ساخنة.
  4. نقل أنابيب PCR من الجليد لthermocycler مع الكتلة محمى إلى 94 درجة مئوية وبدء برنامج ركوب الدراجات. لروتين 3 - PCR الخطوة ، ينبغي أن تكون هناك خطوة واحدة تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية تمسخ و 55 إلى 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية الصلب ، و 65 درجة مئوية التمديد لمدة 20 ثانية ، أو 50 ثانية لكل كيلوبايت. وينبغي أن يتبع ذلك من قبل أحد التمديد النهائي في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ويمكن أيضا في الوقت الحقيقي PCR أن يؤديها لquantitate مبالغ methylcytosine - 5 و 5 hydroxymethylcytosine. يرجى الرجوع إلى دليل المنتجات ، والعثور على neb.com عن معلومات محددة.

4. ممثل النتائج :

الشكل 1
الشكل 1. مقارنة بين 5 - hydroxymethylcytosine المبالغ في 12 موضعا في عينات الأنسجة المختلفة الماوس BALB / C. (A) ، نقطة النهاية PCR. (B) ، في الوقت الحقيقي PCR.

وقد تم تحليل الحمض النووي من الأنسجة الماوس الأربعة. لأغراض المقارنة ، تم تطبيع PCR الوقت الحقيقي للبيانات الحمض النووي غير المصقول. واستخدمت لتحديد المنحنى القياسي في عدد النسخ. ويمكن تطبيع عينات بقسمة عدد نسخ أي من العينات 1-6 قبل عدد نسخة من التحكم الذي هو عسر الهضم (رقم 5). محاصر حارة هلام يظهر التباين في 5 HMC الحالي.

المناقشة

هناك أشياء عدة حاسمة في الاعتبار عند إعداد هذه التجربة. أولا ، من المهم أن glucosylation من الحمض النووي الجينومي العائدات على الانتهاء. ولا يعرف خصوصية تسلسل BGT - T4 ، ويبدو أن لا خيار لتسلسل الركيزة. ولذلك ، في بعض الحالات ، قد تكون أوقات أطول الحضانة اللازمة. ثانيا ، يجب MspI HpaII الهضم وتكون كاملة من أجل تجنب إشارة الخلفية. لتقييد هذه الإنزيمات ، نوصي وقت الحضانة من 4 ساعات ، ولكن لا يمكن أن يؤديها يعد حضانات عندما لوحظ انقسام غير مكتملة. ثالثا ، يمكن تعديلها إدخال كمية الحمض النووي اعتمادا على توافر ، يمكن استخدامها منذ 20 NGS من الحمض النووي لنقطة النهاية PCR. وأخيرا ، فإننا نوصي باستخدام الحمض النووي التحكم الموردة والتي قد تكون بالتوازي مع الحمض النووي الجيني لMC - 5 - 5 وتقدير مؤسسة حمد الطبية.

الإفصاحات

كل من تيد والغجر ، والمؤلفين من هذه المادة ، والعاملين في NEB ؛ الغجر هي المطور الرئيسي للمجموعة ، مع تيد يجري مدير قسم التطوير والتطبيقات التي أشرفت على إعداد هذه المجموعة.

شكر وتقدير

Sriharsa برادان ، شانون موري كيني ، هانغ كيونغ شين ، Jurate Bitinaite ، يو تشنغ ، بيير اوليفييه استيف Romualdas Vaisvila ، والمختبرات ستيفن هاء جاكوبسن ثانية ، جامعة كاليفورنيا. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R44GM095209 - 01.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم تحليل 5-hmC و 5-mC من EpiMark™New England BiolabsE3317
بادئات خاصة بموقع محدد، تحيط بموقع CCGG المستهدفمخصصة حسب التجربة؛ يوفرها المستخدم
إنزيم LongAmp® Taq DNA PolymeraseNew England BiolabsM0323
dNTPsNew England BiolabsN0447
ماء بدرجة نقاء البيولوجيا الجزيئية

المراجع

  1. Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).
  2. Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).
  3. Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).
  6. Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EpiMark 5 hmC MspI HpaII

مقالات ذات صلة