نحن تصف المناعية بسيطة لقياس إنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات ، مثل IL - 1 إنتاج بيتا ، في المرضى الذين يعانون من الظواهر autoinflammatory. من خلال تفعيل خلايا الدم في الثقافات كلها مع الممرض المرتبطة بأنماط الجزيئية ، وتحديدا مع lipopolysaccharide ، يمكن إفراز خلوى تقييم ملائم في supernatants الدم الكامل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دقيقة وبسيطة قياس الموالية للالتهابات سايتوكاين 1β ايل باستخدام تحفيز الدم الجامعة الفحص
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عمليات الالتهابات الناجمة عن إفراز وسطاء للذوبان من قبل الخلايا المناعية ، تؤدي إلى مظاهر مختلفة في الجلد والمفاصل والأنسجة الأخرى ، وكذلك تغيير التوازن خلوى. نظام المناعة الفطري يلعب دورا حاسما في التعرف على مسببات الأمراض وغيرها من المحفزات الذاتية خطر. واحدة من كبرى السيتوكينات الصادرة عن الخلايا المناعية الفطرية هو إينترليوكين (IL) -1. ولذلك ، فإننا الاستفادة من التحفيز الدم الكامل فحص لقياس إفراز السيتوكينات الالتهابية وتحديدا الموالية للالتهابات خلوى 1β IL - 1 ، 2 ، 3.
المرضى الذين يعانون من الخلل الجيني في النظام المناعي الفطرية تسبب متلازمات autoinflammatory تظهر الافراج مبالغ فيها ناضجة IL - 1β على التحفيز مع LPS وحدها. من أجل تقييم المكون الفطري المناعي للمرضى الذين يعانون من التهابات المرتبطة الأمراض ، فإننا نستخدم المناعية محددة للكشف عن الاستجابات المناعية الخلوية إلى الممرض المرتبطة بأنماط الجزيئي (PAMPs) ، مثل الذيفان الداخلي الجرثومي سالبة الجرام ، lipopolysaccharide (LPS ). يتم التعرف على هذه المستقبلات التي PAMPs الاعتراف الممرض (PRRs) ، والتي توجد على خلايا نظام المناعة الفطرية 4 ، 5 ، 6 ، 7. إشارة الأولية ، LPS ، بالاشتراك مع اشارة الثانوية ، ATP ، أمر ضروري لتفعيل inflammasome ، وهو مجمع multiprotein أن العمليات الموالية للIL - 1β إلى شكله ، وناضجة النشطة بيولوجيا 4 ، 5 ، 6 ، 8 ، 9 ، 10.
وفحص الدم الكامل يتطلب الحد الأدنى من التلاعب نموذج لتقييم الانتاج خلوى بالمقارنة مع الطرق الأخرى التي تتطلب عمالة كثيفة ، وعزل السكان استزراع خلايا محددة. هذا الأسلوب يختلف عن غيره من المقايسات كله تحفيز الدم ، بدلا من تمييع العينات مع نسبة من وسائل الإعلام RPMI ، ونحن تنفيذ عدد خلايا الدم البيضاء من الدم مباشرة ، وبالتالي تضعف كله ، وحفز عددا معروفة من خلايا الدم البيضاء في الثقافة 2. نتائج هذا الفحص الدم كله يبرهن على وجود أسلوب خاص رواية مفيد في توضيح الأفواج المريض مع تقديم pathophysiologies autoinflammatory.
البروتوكول
1. جمع الدم الجامعة
- الحصول على الحد الأدنى من 10 مل من الدم المحيطي من الأفراد المتضررين فضلا عن العمر والجنس المتطابقة الاصحاء. وينبغي جمع الدم الوريدي في هيبارين الصوديوم vacutainer أنابيب جمع الدم ، بدلا من استخدام مضادات التخثر الأخرى مثل EDTA ، وعدة مرات لضمان مقلوب الخليط المناسب مع هيبارين الصوديوم. علما أن 10 مل هو حجم الحد الأدنى المطلوب من الدم الكامل للعينات الطلاء في تكرار لهذا الاختبار معينة.
- وينبغي تجهيز العينات في أقرب وقت ممكن بعد جمع للحصول على أفضل النتائج. ومع ذلك ، يمكن تخزين الدم heparinized في درجة حرارة الغرفة تحت الإضاءة الخافتة لمدة تصل إلى 24 ساعة حتى على استعداد لمعالجتها (2).
2. إعداد الدم الجامعة
- الطرد المركزي جميع عينات الدم في 3000 دورة في الدقيقة (مع الفرامل إيقاف) لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. من دون إزعاج معطف الشهباء ، يمكن جمعها في البلازما من أعلى وتخزينها لأغراض تجريبية أخرى. ويمكن تخزين عينات البلازما مؤقتا في -20 درجة مئوية ، أو -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل
- حالما يتم جمع البلازما ، وغسل العينات عن طريق إعادة التعليق على خلايا الدم الحمراء (RBC) وبيليه مع معطف الشهباء مجانا المصل (غير مكتملة) 1640 RPMI وسائل الاعلام (في درجة الحرارة المحيطة). ماصة بلطف المخلوط في أنابيب جمع ونقل إلى أنبوب 50 مل المخروطية.
- حجم ما يصل الى 50 مل مع وسائل الاعلام ناقصة RPMI الثقافة 1640 وعكس بلطف الأنابيب لخلق مزيج متجانس. العينات في جهاز الطرد المركزي 3000 دورة في الدقيقة (مع الفرامل إيقاف) لمدة عشر دقائق. التأكد من وجود فصل واضح ، ونضح طاف ، والحرص على عدم تعكير صفو معطف الشهباء. كرر هذا الإجراء 2-4 مرات للتأكد من أن تتم إزالة كافة الملوثات والسيتوكينات ملزمة قبل التحفيز.
- بعد غسل الماضي ، resuspend الكرية RBC ومعطف الشهباء ذلك أن الحجم الكلي هو 20 مل (لمدة 10 مل من الدم الكامل يوجه مبدئيا) مع وسائل الاعلام ناقصة RPMI 1640. ويمكن تعديل الحجم الكلي على أساس حجم الدم تعادل في البداية.
- باستخدام Cellometer الرؤية ، يمكن عدها الدم المخفف دون lysing كرات الدم الحمراء عن طريق اختيار خلايا الدم البيضاء العد باستخدام الخيار أكريدين البرتقال (AO). أضيف جزءا الدم المخفف AO مع جزء واحد وتحميل 20 ميكرولتر من خليط 01:01 في غرفة الفرز المتاح. وينبغي تركيز النهائي من AO بعد تخفيف يكون 1μg/mL.
- تعديل وفقا لذلك مع وسائل الاعلام غير مكتملة 1640 RPMI إلى تركيز الخلية النهائي من x 2.0 10 6 خلية / مل.
3. التحفيز من الدم الكامل
- في مقايسة يتطلب حدا أدنى من الشروط الأربعة (كل فعل من نسختين) : unstimulated ، إضافة LPS وحدها ، إضافة للاعبي التنس المحترفين وحده ، وأخيرا بطولة LPS زائد واضاف معا. إضافة 1 مل من 2.0 × 10 6 أعد خلايا / مل من الدم الكامل المخفف في البئر المناسبة لزراعة الأنسجة لوحة 24 أيضا.
- ينبغي أن يعاد تشكيل لالمنشطات وترعرعت في درجة حرارة الغرفة قبل البدء في فحص التحفيز. ينبغي أن يعاد تشكيل مجفد LPS و ATP وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد إعادة تشكيل ، ويمكن للاعبي التنس المحترفين وكذلك LPS المخفف إلى التركيز المناسب باستخدام الأسهم غير مكتملة RPMI 1640 وسائل الإعلام.
- إضافة إلى LPS LPS فقط كما كذلك لاعبي التنس المحترفين بالاضافة الى ذلك LPS جيدا أن تركيز العمل النهائية من LPS هو 1 ميكروغرام / مل. الوقت التحفيز مجموع 3 ساعات. ومع ذلك ، يتم تحفيز الدم الكامل مع LPS لمدة 2 ساعة و 40 دقيقة. ينبغي أن توضع العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- يضاف ATP خلال ال 20 دقيقة المتبقية من مدة 3 ساعات التحفيز. إضافة إلى بطولة ATP وحده LPS وبطولة بشكل جيد وعينات من مكان في الحاضنة. تركيز العمل النهائية للبطولة هو 2mm و.
- بعد فترة الحضانة 3 ساعات ، وجمع supernatants بواسطة aliquoting كل عينة في أنبوب مل microcentrifuge 1.5 و الطرد المركزي في وقت لاحق العينات في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل supernatants إلى مجموعة أخرى من الأنابيب microcentrifuge 1.5.
- يمكن أن يعاير عينات مباشرة أو تخزينها مؤقتا في -20 درجة مئوية ، أو -80 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل للتخزين.
4. خلوى الفحص
- العينات التي تم تجميدها لكي تتوازن الحاجة إلى درجة حرارة الغرفة قبل التحليل. يقسم لتركيزات خلوى IL - 1βcan باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق. علينا الاستفادة من الحيوية نوع plex خلوى الإنسان برو X - نوع plex مع نظام مقايسة 200 الصفيف الحيوية ، في تعليمات الشركة الصانعة. في هذا البروتوكول ونحن على وجه التحديد قياس IL - 1β ، ولكن نحن نستخدم هذا الاختبار خلوى متعددة في وقت واحد لقياس السيتوكينات متعددة في واحدة مقايسة مع الاستفادة من استخدام عينة صغيرة الحجم.
5. ممثل النتائج
تحليل IL - 1β على تحفيز الانتاج ناجحة مع LPS و ATP لا يظهرحد ذاته استجابة يعتمد على عدد من الخلايا مستثارة. لقد وجدنا أن 2.0 × 10 6 خلية / مل هو التركيز على انتاج ما يكفي من تركيز الأمثل وقابلة للقياس من IL - 1β فضلا عن السيتوكينات الأخرى (الشكل 2).
فحوصات الدم كلها مفيدة في دراسة المرضى التي تقدم مع مظاهر autoinflammatory. قد هؤلاء المرضى تظهر وجود خلل في نظام المناعة الفطرية ، والتي يمكن وصفها من قبل الافراط في IL - 1β (بالمقارنة مع الضوابط) على التحفيز مع وحده LPS (الشكل 3).
الشكل 1. تلطيخ صورة ممثل عن AO الأنوية خلايا الدم البيضاء تستخدم لتحديد تركيز خلية في تخفيف عينات الدم الكامل.
الشكل 2. IL - 1β الإنتاج يقاس في الدم supernatants كلها من متبرع سليم على التحفيز مع LPS الخلية بتركيزات متزايدة. ويعاير العينات في ثلاث نسخ.
الشكل 3. نتائج ممثل إفراز IL - 1β تقاس supernatants الدم الكامل من الضوابط two طبيعية وصحية فضلا عن اثنين من المرضى الذين يعانون من IL - 1β المرتبطة autoinflammatory مظاهره.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وفحص الدم الكامل ووصف هو أسلوب بسيط هو أن أوثق يحاكي الظروف الفسيولوجية بالمقارنة مع غيرها من التقنيات التي تتطلب عزل الخلايا واسعة تجهيز العينات والتلاعب. هذه الطريقة تستخدم مع الرؤية Cellometer AO لحساب خلايا الدم البيضاء في الدم كله ، وبالتالي ، يوفر وسيلة لتوحيد عينات بدقة بناء على أرقام الخلية.
لا بد من ملاحظة أن لهذا الاختبار ، وينبغي استخلاص الدروس من الدم الكامل في أنابيب جمع هيبارين الصوديوم كما هي معروف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية للمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العظام والعضلات والجلد من المعاهد الوطنية للصحة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب جمع الدم التي تحتوي على هيبارين الصوديوم | BD Biosciences | 366480 | |
| وسط RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| أكريدين برتقالي | Invitrogen | A3568 | |
| جهاز Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | اتصل بالشركة للحصول على معلومات حول الجهاز | |
| غرف عد الخلايا Cellometer | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| صفيحة زراعة أنسجة ذات 24 بئرًا | Corning | 3524 | |
| K12 LPS عالي النقاء من E. coli | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| ملح ثنائي الصوديوم المميّه لـ Adenosine 5´-tripohasphate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| نظام Bio-plex 200 | Bio-Rad | اتصل بالشركة للحصول على معلومات حول الجهاز | |
| مقايسة Bio-Plex Pro للسيتوكينات البشرية x-plex | Bio-Rad | يتم تصنيع مقايسات x-plex حسب الطلب وفقًا للسيتوكينات المحددة المطلوبة |
المراجع
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
