تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

ملخص

الوصل العصبي العضلي (NMJ) من ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو نظام نموذجا هاما لدراسة وظيفة متشابك العادي فضلا عن اضطرابات في وظيفة متشابك وجدت في بعض الأمراض العصبية. نقدم بروتوكول للتشريح ذبابة الفاكهة نظام المحرك اليرقات وimmunostaining عن البروتينات النشطة داخل منطقة NMJ.

الملخص

يرقات ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو نموذج ممتاز لدراسة بنية ووظيفة متشابك. ذبابة الفاكهة هو معروف جيدا لسهولة التلاعب الجيني قوية والنظام العصبي اليرقات وقد ثبت في دراسة مفيدة بشكل خاص ليس فقط وظيفة عادية ولكن أيضا اضطرابات التي تصاحب بعض الأمراض العصبية (لويد وتايلور ، 2010). وتوجد أيضا العديد من الجزيئات مفتاح متشابك وجدت في ذبابة الفاكهة في الثدييات ومثل معظم نقاط الاشتباك العصبي CNS مثير في الثدييات ، وذبابة الفاكهة وNMJ glutamatergic ويوضح نشاط تعتمد على إعادة عرض (كوه وآخرون ، 2000). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن الخلايا العصبية تكون ذبابة الفاكهة التي تم تحديدها بشكل فردي بسبب أنماط تعصيب هم النمطية والتكرار مما يجعل من الممكن لدراسة محطات متشابك المحددة ، مثل تلك التي بين الخلايا العصبية الحركية والألياف العضلية الجسم الجدار أنهم يعصب (Keshishian وكيم ، 2004). وجود مكونات المشبك الحفاظ تطويريا مع سهولة التلاعب الجيني والجسدي جعل النموذج المثالي لذبابة الفاكهة التحقيق في الآليات الكامنة وراء وظيفة متشابك (Budnik ، 1996).

المناطق النشطة في محطات متشابك ذات أهمية خاصة لأن هذه هي مواقع لإطلاق العصبي. NC82 هو ريتوكسيماب تعترف البروتين ذبابة الفاكهة Bruchpilot (BRP) ، أحد أفراد العائلة CAST1/ERC التي هي عنصر مهم من منطقة نشطة (Wagh وآخرون ، 2006). وقد تبين لBRP شكل مباشر على منطقة نشطة تي بار ، وهي مسؤولة عن تجميع فعال كا ^{2 +.} قنوات تحت كثافة تي بار (فوكيه وآخرون ، 2009) قللت من المسوخ BRP كا ^{2 +} قناة كثافة ، والاكتئاب أثار إطلاق سراح الحويصلة ، واختلال في الأجل القصير اللدونة (Kittel وآخرون ، 2006). وقد لوحظت تغييرات على المناطق النشطة في نماذج مرض ذبابة الفاكهة. على سبيل المثال ، أظهرت المناعي باستخدام الأجسام المضادة التي تم NC82 انخفضت كثافة المنطقة النشطة في نماذج من التصلب الجانبي الضموري وبيت هوبكنز متلازمة (Ratnaparkhi وآخرون ، 2008 ؛. Zweier وآخرون ، 2009). وبالتالي ، قد تقييم المناطق النشطة ، أو البروتينات متشابك أخرى ، يرقات ذبابة الفاكهة في نماذج من الأمراض تقديم فكرة قيمة الأولية إلى وجود خلل متشابك.

يستعد كامل يرقات ذبابة الفاكهة يشن تشريح للتحليل المناعي للNMJ يتطلب بعض المهارة ، ولكن يمكن تحقيقه من قبل معظم العلماء مع القليل من الممارسة. قدم هو الأسلوب الذي ينص على أن تكون يرقات العديد من تشريح وimmunostained في طبق تشريح نفسه ، مما يحد من الاختلافات البيئية بين التركيب الوراثي وتوفير كل الحيوانات ما يكفي للثقة في استنساخ والتحليل الإحصائي.

البروتوكول

1. استعدادا لالمناعي :

1. لإنشاء سطح تشريح ، صب Sylgard سيليكون إلاستومر 184 قاعدة في لوحة الثقافة الأنسجة الصغيرة. تأكد من عدم ملء طبق ذلك تماما أن منطقة تشريح أقل من الحافة.
2. تقليم دبابيس تشريح لمدة حوالي 3.5mm لتسهيل زيادة التلاعب ، وتأكد من أن ما لا يقل عن 6 دبابيس في اليرقة.
3. ستحتاج ملقط واضحة وهي أن تسمح لك فهم دبابيس للتشريح.

2. تشريح اليرقات :

المناقشة

عن الخلايا العصبية ، ومنطقة محطة متشابك هو أمر بالغ الأهمية ، وجسر للتواصل السليم بين آخر وخلايا ما قبل متشابك. وسيلة قوية للتحقق من صحة الخلايا العصبية في نماذج المرض هو تحليل البروتينات من محطة متشابك بواسطة المناعي. الأسلوب المناعي المعروضة هنا تمكن الباحث لدراسة العديد من اليرقات في الوقت نفسه مع الحد من الاختلافات بين الجماعات البيئية. الجهاز العصبي المركزي من يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي الثالث العديد من المزايا بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic ، تعيين.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم الكاشف	شركة	رقم كتالوج	تعليقات
Sylgard سيليكون إلاستومر 184 قاعدة	داو كورننغ	68037-59-2	بعد خلط تسمح لفقاعات في الارتفاع ببطء من خلال وضع على محور دوار بطيئة أو السماح للجلوس لمدة 30 دقيقة أو أكثر.
الفولاذ المقاوم للصدأ دبابيس Minutien	أدوات العلوم غرامة	26002-10	لتقليم تقريبا. 3 - 4mm في الطول مع مقص العادية
الملقط استئصال الصفيحه (بلانت استخدامها لاستيعاب دبابيس)	أدوات العلوم غرامة	11223-20	يستعمل مثل كليلة ملقط لاستيعاب دبابيس
تشريح الملقط	العالم آلات دقيقة	501985
فائق الجودة Vannas مقصات 8cm طويلة	العالم آلات دقيقة	501778
الماوس المضادة للأجسام المضادة BRP	DSHB	NC82	استخدام تخفيف 01:50
Cy3 Affinipure عنزة مكافحة الفجل البيروكسيداز	جاكسون Immunoresearch	123-165-021	استخدامها في التخفيف 1:200
الكسا فلور 488 عنزة المضادة للماوس مفتش	Invitrogen	A11001	استخدام تقريبا. 1:200 تخفيف