الوصل العصبي العضلي (NMJ) من ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو نظام نموذجا هاما لدراسة وظيفة متشابك العادي فضلا عن اضطرابات في وظيفة متشابك وجدت في بعض الأمراض العصبية. نقدم بروتوكول للتشريح ذبابة الفاكهة نظام المحرك اليرقات وimmunostaining عن البروتينات النشطة داخل منطقة NMJ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يرقات ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو نموذج ممتاز لدراسة بنية ووظيفة متشابك. ذبابة الفاكهة هو معروف جيدا لسهولة التلاعب الجيني قوية والنظام العصبي اليرقات وقد ثبت في دراسة مفيدة بشكل خاص ليس فقط وظيفة عادية ولكن أيضا اضطرابات التي تصاحب بعض الأمراض العصبية (لويد وتايلور ، 2010). وتوجد أيضا العديد من الجزيئات مفتاح متشابك وجدت في ذبابة الفاكهة في الثدييات ومثل معظم نقاط الاشتباك العصبي CNS مثير في الثدييات ، وذبابة الفاكهة وNMJ glutamatergic ويوضح نشاط تعتمد على إعادة عرض (كوه وآخرون ، 2000). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن الخلايا العصبية تكون ذبابة الفاكهة التي تم تحديدها بشكل فردي بسبب أنماط تعصيب هم النمطية والتكرار مما يجعل من الممكن لدراسة محطات متشابك المحددة ، مثل تلك التي بين الخلايا العصبية الحركية والألياف العضلية الجسم الجدار أنهم يعصب (Keshishian وكيم ، 2004). وجود مكونات المشبك الحفاظ تطويريا مع سهولة التلاعب الجيني والجسدي جعل النموذج المثالي لذبابة الفاكهة التحقيق في الآليات الكامنة وراء وظيفة متشابك (Budnik ، 1996).
المناطق النشطة في محطات متشابك ذات أهمية خاصة لأن هذه هي مواقع لإطلاق العصبي. NC82 هو ريتوكسيماب تعترف البروتين ذبابة الفاكهة Bruchpilot (BRP) ، أحد أفراد العائلة CAST1/ERC التي هي عنصر مهم من منطقة نشطة (Wagh وآخرون ، 2006). وقد تبين لBRP شكل مباشر على منطقة نشطة تي بار ، وهي مسؤولة عن تجميع فعال كا 2 +. قنوات تحت كثافة تي بار (فوكيه وآخرون ، 2009) قللت من المسوخ BRP كا 2 + قناة كثافة ، والاكتئاب أثار إطلاق سراح الحويصلة ، واختلال في الأجل القصير اللدونة (Kittel وآخرون ، 2006). وقد لوحظت تغييرات على المناطق النشطة في نماذج مرض ذبابة الفاكهة. على سبيل المثال ، أظهرت المناعي باستخدام الأجسام المضادة التي تم NC82 انخفضت كثافة المنطقة النشطة في نماذج من التصلب الجانبي الضموري وبيت هوبكنز متلازمة (Ratnaparkhi وآخرون ، 2008 ؛. Zweier وآخرون ، 2009). وبالتالي ، قد تقييم المناطق النشطة ، أو البروتينات متشابك أخرى ، يرقات ذبابة الفاكهة في نماذج من الأمراض تقديم فكرة قيمة الأولية إلى وجود خلل متشابك.
يستعد كامل يرقات ذبابة الفاكهة يشن تشريح للتحليل المناعي للNMJ يتطلب بعض المهارة ، ولكن يمكن تحقيقه من قبل معظم العلماء مع القليل من الممارسة. قدم هو الأسلوب الذي ينص على أن تكون يرقات العديد من تشريح وimmunostained في طبق تشريح نفسه ، مما يحد من الاختلافات البيئية بين التركيب الوراثي وتوفير كل الحيوانات ما يكفي للثقة في استنساخ والتحليل الإحصائي.
البروتوكول
1. استعدادا لالمناعي :
- لإنشاء سطح تشريح ، صب Sylgard سيليكون إلاستومر 184 قاعدة في لوحة الثقافة الأنسجة الصغيرة. تأكد من عدم ملء طبق ذلك تماما أن منطقة تشريح أقل من الحافة.
- تقليم دبابيس تشريح لمدة حوالي 3.5mm لتسهيل زيادة التلاعب ، وتأكد من أن ما لا يقل عن 6 دبابيس في اليرقة.
- ستحتاج ملقط واضحة وهي أن تسمح لك فهم دبابيس للتشريح.
2. تشريح اليرقات :
- حدد يتجول third طور مرحلي اليرقات التي يتم الزحف حول جوانب القارورة ولم تبدأ إلى تخدر تصبح خادرة.
- وضع اليرقات على سطح تشريح تحت stereomicroscope. ذبالة بعيدا رطوبة الزائدة باستخدام Kimwipe.
- ترتيب كل يرقة بحيث الجانب الظهري يكون مواجها لها. سوف تكون قادرة على أن نرى اثنين من القصبة الهوائية ، وخطوط بيضاء على طول الجانب الظهري من اليرقات. هذه محاولة لمركز في وسط أكبر قدر ممكن لأن هذا يمثل خط الوسط الظهرية.
- دبوس مكان # 1 فقط أعلاه السنانير الفم (الشكل 1).
- مكان دبوس # 2 في الذيل فقط فوق spiracles بين الرغامى.
- إضافة كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني لليرقات لمنع جفاف بشرة.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه مع جميع اليرقات ، والتأكد من أن يتم فصل المورثات مكانيا عن طريق وضع دبوس بين كل الوراثي.
- جعل الحق قطع صغيرة عرضية أعلاه دبوس # 2 في كلا القصبات (الشكل 1).
- إدراج المقص الخاص بك في أول خفض وقطع على طول خط الوسط الظهرية بين القصبات على طول الطريق حتى دبوس الماضي # 1.
- سوف تحتاج إلى إجراء تخفيضات أخرى صغيرة في أسفل أعلى جدا ولكل جانب من إهاب ، حتى أن الجانبين الأيسر والأيمن سيفتح يسمح لك ملاحقتهم دون سحب على بشرة.
- مكان دبوس # 'ق 3 ، 4 ، 5 ، و 6 في كل زاوية.
- الإصلاح العينة مع PFA 4 ٪ ل20-25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة
- صب في منهاج العمل وشطف مع أوقات PBS 3-4 ، الصب في كل مرة.
3. إزالة الأنسجة :
- بدء بواسطة إزالة أنسجة في نهاية الخلفي لأن عادة تريد حماية المنطقة حيث يقع الدماغ.
- في حين تستخدم وsteromicroscope مع اليرقات تحت قطرة من برنامج تلفزيوني ، والاستيلاء على أول الخلفي نهاية واحد من القصبة الهوائية وتخلعها التي قد تؤدي الى ازالة بعض الدهون في الجسم معها. تكرار للالقصبة الهوائية الثانية.
- الاستيلاء على بعض الدهون من الجسم الخلفي أو الأمعاء وتسحبهم من الإعدادية. مرة واحدة تمت إزالة معظم الأنسجة الخلفي ، والتركيز على إزالة أنسجة صغيرة حول الدماغ. إذا كنت مهتما فقط في العضلات ، أو مورفولوجية NMJ يمكنك إزالة المخ كذلك.
- إزالة الدماغ يسمح للأفضل تصور العضلات 31 ، التي هي علامة من المفيد التوجه للقطاع في منطقة البطن.
4. المناعي للمناطق تواجد في :
- إضافة عامل محصر (5 ٪ مصل الماعز عادي في برنامج تلفزيوني) إلى محضرات تشريح في طبق تشريح. كتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إذا كنت ترغب في جعل حل واحد فقط من أجل الحيلولة دون والضد التخفيفات ، وتشمل 0.1 ٪ TritonX - 100 إلى وكيلك لحجب permeabilization الأنسجة.
- تطبيق الضد الابتدائية المخفف في عرقلة كاشف بنسبة 0.1 ٪ TritonX - 100. الأجسام المضادة النشطة المنطقة يمكن تحقيقه من خلال البنك التنموي ورم هجين دراسات (DSHB ، http://dshb.biology.uiowa.edu/). استخدام الأجسام المضادة المرجعية (مثل الفجل البيروكسيداز - Cy3 المتقارن) لتسمية غشاء NMJ والمحاور.
- احتضان الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية خلال الليل. بحيث جفاف الثلاجة ولن تتبخر الحل الأضداد ، إنشاء غرفة الرطوبة عن طريق وضع بعض الماء في الجزء السفلي من مربع ماصة تلميح المستخدمة. تغطية غطاء شفاف برقائق الألومنيوم للحد من الفلورسنت تبييض. ضع الشريحة في غرفة التشريح الرطوبة وضعت كلها في خانة الحاضنة 4 درجات مئوية خلال الليل.
- في صباح اليوم التالي ، وغسل مع PBST (PBS مع 0.2 ٪ تريتون - X - 100) 5-10 مرات لمدة 5-10 دقائق لكل منهما.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (مثل الماعز اليكسا Invitrogen المضادة للماوس - 488) في عرقلة كاشف المخفف بنسبة 0.1 ٪ TritonX - 100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-4 ساعات في غرفة غطت الرطوبة. وتشمل وصمة النووية (على سبيل المثال دابي) في الثانوية ، إذا كنت ترغب في التعرف على مكان وجود النواة في العضلات أو الدماغ.
- يغسل مع PBST (PBS مع 0.02 ٪ تريتون - X - 100) 5-10 مرات لمدة 5-10 دقائق لكل منهما.
5. تركيب عينات اليرقات على الشرائح :
- صب والفتيل قبالة يغسل PBST الماضي.
- ماصة 1mL الجلسرين حوالي 80 ٪ لتغطية جلد تمركزها اليرقات.
- إزالة 5 من 6 دبابيس في جميع اليرقات.
- عندما كنت على استعداد لوضع النمط الجيني الأول على شريحة إزالة دبوس الماضي ليرقات كل ذلك genotyبي.
- تعد "غسل" الشريحة من خلال وضع قطرتين من المتوسط الخاص المتزايدة على شريحة نظيفة. هذه الخطوة مهمة لغسل الحل المياه قبالة اليرقات لتركيب وأوضح التصوير.
- اليرقة انتزاع واحدة من ذيله مع ملقط الخاص حادة ، اسحب اليرقة حولها في الجلسرين ثم على طول الحواف الجافة في طبق تشريح الخاص ، لإزالة الغالبية العظمى من الجلسرين. وضع اليرقات في أول انخفاض المتوسطة المتزايدة.
- كرر الخطوة 6 لجميع اليرقات في التركيب الوراثي نفسه.
- مرة واحدة كل اليرقات في أول انخفاض متوسط المتصاعدة ، والاستيلاء على يرقة أول من الذيل وتسحبه من خلال الانخفاض ومن ثم على طول الحواف الجافة من الطبق لإزالة غالبية المتوسط. ثم ضع اليرقات في ثاني انخفاض المتوسطة المتزايدة.
- كرر الخطوة 8 لجميع اليرقات مع التركيب الوراثي نفسه.
- إعداد الشريحة النهائية من وضع العلامات عليها ووضع "T" صغيرة شكل المتوسطة المتزايدة على الشريحة.
- كما في الخطوة 5.8 ، والاستيلاء على يرقة من ذيله ؛ سحب قذف من خلال تصاعد ثاني انخفاض المتوسط ثم على طول الجانبين الجافة الشريحة "غسل". بعد أغلبية متوسطة وتؤتي ثمارها ، ومكان لقذف اليرقات على الشريحة المتوسطة النهائي في تصاعد مستمر.
- أكرر للجميع اليرقات جلد.
- تأكد من أن يتم ترتيب جميع اليرقات جلد على النحو المرغوب فيه والتأكد من أن الجانب بشرة باستمرار والعضلات تتعرض يكون مواجها لها.
- زلة تغطية مكان على الشريحة لتغطية تشريح اليرقات ، مع الحافة التي تبدأ في السطر العلوي من "T."
- وضع الوزن الصغيرة (مثل بطارية 9 فولت) على تغطية زلة ، والتأكد من أن تصاعد المتوسطة ينتشر تماما تحت الغطاء زلة.
- للحد من التبريد الفلورسنت ممكن ، ضع الشريحة في الدرج أو في الفضاء المظلم حتى المتوسطة المتزايدة والشفاء.
- تنظيف المتوسطة المتزايدة التي فاضت وارتفع من انزلاق الغطاء. تنظيف الجاف المتوسط قبالة الزائدة متزايدة على تغطية زلة أو الشريحة مع الايثانول 70 ٪.
- لإنشاء الختم النهائي ، وختم بطلاء الأظافر.
6. ممثل النتائج :
ويرد على سبيل المثال شريحة من اليرقات وتشريح immunostained في الشكل 2. عند الانتهاء من تشريح اليرقات ، والبقع ، وتصاعد بشكل صحيح ، يمكن للمستخدم تحديد العضلات يرقات الفائدة (الشكل 3) في قطاعات A2 - A6. هوانغ وآخرون. يقدم وصفا تفصيليا لموقف العضلات وكذلك توصيف حبات متشابك محددة (هوانغ وشيبا ، 2001). الهدف باستخدام قوة عالية يمكن للمستخدم التركيز على المشبك واحد ، واتخاذ ض المكدس الصورة. ويظهر إسقاط الحد الأقصى صورة ممثل لجزء من المشبك 07/06 (الشكل 4). ثم استخدام برامج التصوير ، ويمكن تقييم المناطق نشاطا من الناحية الكمية عن الخصائص التي هي خاصة لهيئتك الفيزيائية متحولة. أمثلة من الميزات التي يمكن تغييرها في النمط الظاهري متحولة الخاصة تشمل العدد الكلي ، وكثافة flourescence ، وتباعد بين المناطق النشطة.
مطبات محتملة :
التقييم المناعي من مفترق الطرق العصبية والعضلية اليرقات هو نظام القيم الذي يمكن أن توفر معلومات قيمة حول البيولوجيا متشابك ، وإن كانت هناك مطبات المحتملة التي يمكن أن تحد من فائدة هذا النظام. على سبيل المثال ، غالبا ما يكون من المرغوب فيه صورة لنمط تلطيخ اثنين أو أكثر من الاجسام المضادة الابتدائية في نفس العينة. اختيار الأجسام المضادة الأولية المناسبة ، fluorophores المناسبة ، وعناصر سلبية المناسبة أمر ضروري لتحقيق النجاح.
إذا كان التصوير two المستضدات في تجربتك ، تكون على يقين من أن الأجسام المضادة الأولية هي من أنواع مختلفة بحيث يمكن لكل من البروتين الفائدة المحددة فريد مع جسم ثانوية fluorescently المسمى. وهناك طريقة للحد من أوصى الخلفية لاستخدام عامل محصر تحتوي على مصل من الأنواع العادية من التي كانت مستمدة من الأجسام المضادة الثانوية (مثل استخدام مصل طبيعي الماعز كعامل حظر عند استخدام الماعز المضادة للأرنب أو الماوس المضادة للأضداد الثانوية).
بعد تخطيط الأجسام المضادة الابتدائية والثانوية التي ستستخدمها في تجربتك ، يجب عليك أن تنظر أيضا بما في ذلك عناصر التحكم في تلطيخ الخاص مجموعات لضمان أن الإشارة الفلورسنت التي ترونه هو حقيقي وليس مجرد خلفية. إذا كان ذلك ممكنا ، وتشمل عينات السيطرة السلبية التي لا تحتوي على البروتين من الفائدة. ويتم ذلك بسهولة في دراسات overexpression التحوير الخارجية التي تشمل الحيوانات البرية النوع ، ولكن في بعض الحالات يمكن إنجازه باستخدام متحولة متماثل من البروتين الخاص بك من الفائدة. تحكم آخر أساسي السلبية ، مفيدة لقياس مستويات خلفية إشارة نيون ، هي استخدام الأجسام المضادة الثانوية بما في ذلك دون الابتدائي. عند التصوير الخاص محضرات الناتجة عن ذلك ، فمن المهم أن نفهم أن كل إشارة الفلورسنت التي نشهد قد لا تكون حقيقية ، وربما تكون الخلفية من يوالأجسام المضادة الثانوية اور أو من خلفية الأنسجة الداخلية. قد تحتاج لتطبيع الصور الخاص للنظر في مضان الخلفية عند معايرة للتغييرات بين كثافة مضان.
ويجب أيضا اختيار fluorophore يتم بحذر. النظر في الإثارة والأطياف الانبعاثات لكل fluorophore والقدرة على اكتشاف فريد كل إشارة أمر ضروري لتجنب النزف من خلال القناة. إذا كان هناك أي غموض ، وهي طريقة بسيطة لتحديد ما إذا كان ينزف من خلال مدى هو immunostain مع الضد fluorophore المسمى واحد في وقت وشيك مع كل صورة القناة التي سوف تستخدم في التجربة النهائية. هذا ينبغي أن يكشف عما اذا تنزف يحدث من خلال المجهر الخاص مع مجموعة التصفية.
الشكل 1. مخطط تدفق قطع جليدة ووضع دبابيس 1-6. انقر هنا لعرض صورة أكبر حجما
الشكل 2. تنسيب اليرقات على الشريحة النهائية. تأكد من أن يتعرض لها الجانب محضرات اليرقات العضلات وحتى الجانب بشرة أسفل. ترك ما لا يقل عن العرض في جسم اليرقات بين كل عينة.
الشكل 3. عند التصوير ، وتحديد العضلات وشرائح الفائدة. تقاطعات مشتركة تتميز عضلات الاعصاب يعصب 6 / 7 ، 13 في العضلات ، والعضلات 12 ، أو العضلات 4. على الجانب الآخر من خط الوسط بطني ، وهناك بنية العضلات صورة مرآة للجزء ، أظهرت نصفي. استخدام العضلات 31 كمؤشر لتحديد الجزء الذي كنت التصوير. صورة نقاط الاشتباك العصبي نفسه وشرائح لبقية العينات الخاصة بك ، وجمع العديد من الصور متشابك في التركيب الوراثي والتي يمكن استخدامها لتقدير.
الشكل 4. يظهر إسقاط الحد الأقصى ممثل صورة لجزء من عضلة NMJ التعصيب 07/06. ويرد NC82 (Bruchpilot) تلوين باللون الأخضر. ويرد HRP قبل متشابك وصمة عار في الحمراء. لاحظ punctae المنطقة النشطة التي يمكن قياسها كميا المزيد من برامج التصوير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عن الخلايا العصبية ، ومنطقة محطة متشابك هو أمر بالغ الأهمية ، وجسر للتواصل السليم بين آخر وخلايا ما قبل متشابك. وسيلة قوية للتحقق من صحة الخلايا العصبية في نماذج المرض هو تحليل البروتينات من محطة متشابك بواسطة المناعي. الأسلوب المناعي المعروضة هنا تمكن الباحث لدراسة العديد من اليرقات في الوقت نفسه مع الحد من الاختلافات بين الجماعات البيئية. الجهاز العصبي المركزي من يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي الثالث العديد من المزايا بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic ، تعيين...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور نائل العلمي والدكتور كيم نام تشول على تعليقاتهم المفيدة حول هذا المخطوط.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | شركة | رقم كتالوج | تعليقات |
| Sylgard سيليكون إلاستومر 184 قاعدة | داو كورننغ | 68037-59-2 | بعد خلط تسمح لفقاعات في الارتفاع ببطء من خلال وضع على محور دوار بطيئة أو السماح للجلوس لمدة 30 دقيقة أو أكثر. |
| الفولاذ المقاوم للصدأ دبابيس Minutien | أدوات العلوم غرامة | 26002-10 | لتقليم تقريبا. 3 - 4mm في الطول مع مقص العادية |
| الملقط استئصال الصفيحه (بلانت استخدامها لاستيعاب دبابيس) | أدوات العلوم غرامة | 11223-20 | يستعمل مثل كليلة ملقط لاستيعاب دبابيس |
| تشريح الملقط | العالم آلات دقيقة | 501985 | |
| فائق الجودة Vannas مقصات 8cm طويلة | العالم آلات دقيقة | 501778 | |
| الماوس المضادة للأجسام المضادة BRP | DSHB | NC82 | استخدام تخفيف 01:50 |
| Cy3 Affinipure عنزة مكافحة الفجل البيروكسيداز | جاكسون Immunoresearch | 123-165-021 | استخدامها في التخفيف 1:200 |
| الكسا فلور 488 عنزة المضادة للماوس مفتش | Invitrogen | A11001 | استخدام تقريبا. 1:200 تخفيف |
المراجع
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
- Hoang, B., Chiba, A. Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses. Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).
- Keshishian, H., Kim, Y. -S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
- Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity. Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism. PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).
- Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
- Zweier, C., Jong, E. K. de, Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
