يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

Summary

خلايا الموت تنبثق من الأنسجة الطلائية التي تقلص متضافرة من الخلايا المجاورة دون تعطيل وظيفة الحاجز. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف أساليب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات في القرار الخلوية.

Abstract

استتبابي صيانة الأنسجة الطلائية المستمر يتطلب إزالة الخلايا التالفة من دون تعطيل وظيفة الحاجز. ووصف عملية دراستنا وجدنا أن الخلايا الميتة إرسال إشارات إلى جيرانهم العيش في تشكيل وعقد حلقة من الأكتين والميوسين التي يقذف بها من ورقة الظهارية في حين إغلاق أي ثغرات يمكن أن تكون قد نتجت عن خروجها ، قذف الخلية ^1. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف الأسلوب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات. لتصور البثق ، ونحن حقن بروتين فلوري الأحمر المسبار المسمى لأكتين F - الأجنة في مرحلة واحدة خلايا معدلة وراثيا الزرد التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء في البشرة ويحفز موت الخلايا المبرمج عن طريق إضافة إلى G418 اليرقات. ثم نستخدم الوقت الفاصل بين التصوير على القرص الغزل مبائر المجهر لمراقبة ديناميات أكتين والسلوكيات الخلايا الظهارية أثناء عملية قذف الخلية أفكارك. هذا الأسلوب يتيح لنا للتحقيق في عملية قذف في ظهائر العيش وسوف توفر وسيلة لدراسة الحالات المرضية الناجمة عن الفشل في القضاء على الخلايا أفكارك.

Protocol

الأساسية لسير العمل في التصور من خلال حيوية أكتين النتوء خلية في البشرة من اسماك الزرد النامية

وتتألف البشرة من الزرد النامية من طبقتين متميزة ، الطبقة السطحية (أو محيط بالأدمة) وطبقة من الخلايا القاعدية التي تتصل الغشاء القاعدي ^2. خلايا طبقة السطح الخارجي يخضع موت الخلايا المبرمج ويتم التخلص من النسيج بواسطة البثق ³ (الشكل 1). تصور هذه العملية في الوقت الحقيقي ، ونحن حقن البروتين RNA أحمر فلوري ترميز تنصهر إلى المجال للتناظر calponin utrophin ، وهو بروتين ملزمة أكتين (RFP - UtrCH) ^4،5 ، في خلية واحدة ، معربا عن المرحلة الزرد المعدلة وراثيا ببروتين أخضر (GFP ) تحت cytokeratin طبقية المروج ظهائر 8 ⁶ (الشكل 2A). على الرغم من أنه أعرب عن بتواجد مطلق RFP - UtrCH في الحيوان بعد حقن الحمض النووي الريبي ، ونحن نركز على خلايا البشرة السطحية التي تعبر عن كل من طلب تقديم العروض وGFP لمتابعة أكتين ديناميات تحديدا في البشرة (الشكل 2B). ثم اننا نتعامل مع اليرقات G418 للحث على أفكارك قذف الخلية وصورة شعيرات أكتين البشرة وباستخدام مجهر القرص الغزل والحصول على مجموعات البيانات مبائر 4D.

قبل بدء التجربة

1. في المختبر نسخ الحمض النووي الريبي DNA من قالب خطي باستخدام mMachine mMessage SP6 مجموعة (Ambion) وتنقية باستخدام الحمض النووي الريبي توج RNeasy البسيطة مجموعة (Qiagen). يخفف من الحمض النووي الريبي ل~ 60ng/ul باستخدام الماء المعقم ، وجعل 3 5μl aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للحقن. ملاحظة : تجنب تكرار تجميد / الذوبان لمنع تدهور الحمض النووي الريبي.
2. جعل قالب لعقد أجنة خلال الحقن عن طريق سكب 40mL agarose من 2 ٪ في المتوسط ​​الجنين E3 (E3) في لوحة الثقافة 15mm × 100 ووضع قالب microinjection (التكيفية أدوات العلم ، # I - 34) في هذا الدرج. مرة واحدة وقد عززت agarose ، إزالة العفن لفضح أجران في agarose. متجر لوحة في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
3. سحب شعري للحقن الإبر باستخدام الزجاج البورسليكات مع شعيرات (OD 1.0mm ، ID 0.78 ، طول 10cm) وبولير سوتر الماصة P - 97 في الإعدادات التالية (هيت 485 ، سحب 50 ، سرعة 60 ، والتأخر / الوقت 90 ، 200 ضغط ). ملاحظة : هناك أنواع مختلفة من الزجاج وسوف تتطلب التحسين من الشروط المذكورة.
4. يشكلون 1 ٪ قليلة الذوبان (LM) agarose في aliquots 1mL E3 وتخزين حوالي 42 درجة مئوية. كن حذرا كما تبخر E3 من مخزون يمكن أن تزيد من تركيز agarose.
5. الحفاظ على الزرد الكبار تحت ظروف المختبر القياسية ، مع ضوء العادية / دورة الظلام للضوء 14 ساعة و 10 ساعة من الظلام ^7. في الليلة التي سبقت تجربة إعداد الأسماك للتزاوج من خلال وضع 3 إناث والذكور 2 في خزان مفصولة المفرق. في صباح اليوم التالي ، وتغيير المياه في الخزان وسحب مقسم عندما تتسلط الأضواء على.

1. حقن البروتين RNA ترميز أكتين الكلمات الدلالية Fluorescently تجليد

1. ذوبان الجليد على الحمض النووي الريبي. إضافة الفينول الأحمر 0.5 ٪ إلى الحمض النووي الريبي في نسبة 1:1 لتركيز النهائي من الحمض النووي الريبي 30ng/μl ~ وتحميل حل 1μl في إبرة الشعرية سحبت عن طريق ملء الخلفي.
2. ~ جمع 75 1 ⁸ خلايا المرحلة CK : GFP الأجنة في E3. الماصة للالماصة باستور جمع الأجنة في القالب microinjection مع 5 ¾ وتوجيه بلطف الأجنة في الحوض الصغير مع دومون FST # 5 ملقط. ملاحظة : احرص على العمل بسرعة لتجنب الحقن في مرحلة الجنين متعددة الخلايا ، مما يؤدي إلى التعبير عن فسيفساء من حقن الحمض النووي الريبي.
3. تحت stereomicroscope مختبر تشريح القياسية ، حقن الحمض النووي الريبي في صفار من أجنة باستخدام microinjector الضغوط التي تسيطر عليها (هارفارد جهاز PLI - 100 - الحاقن بيكو). وينبغي أن يكون بقعة حمراء (أحمر الفينول) تكون مرئية في الجنين بعد الحقن. ضخ ما لا يقل عن 50 الأجنة لكل تجربة. (انظر البروتوكول إن الرب السابق لبروتوكول مفصلة عن حقن الحمض النووي الريبي في الأجنة الزرد ^9). ملاحظة :
   1. وينبغي استخدام حجم ~ 2nl للحقن في واحدة من الحمض النووي الريبي خلايا الأجنة المرحلة. لتحديد كمية من الحمض النووي الريبي حقن ، الاستغناء a بلعة من الحمض النووي الريبي في قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرون معايرة أو تحت المجهر مع شريط النطاق في صلب العدسات. ينبغي أن يكون قطرة من الحمض النووي الريبي كرة مثالية. حساب المبلغ الذي ألقاه باستخدام المعادلة : المجلد (في هولندا) = 4/3πr ^3. ضبط حجم تسليمها عن طريق تغيير ضغط الحقن أو الوقت على الصك.
   2. وينبغي أيضا الحرص على حقن بأقل كمية من الحمض النووي الريبي الذي يسمح التصور من fluorophore ، وتركيزات عالية من الحمض النووي الريبي يمكن أن تكون سامة إلى الجنين النامي. المناسبة لتحديد مستوى التعبير ، ينبغي إجراء تجربة جرعة منحنى قبل تشغيل التجربة.
4. فرز الأجنة لإزالة أي بويضة غير مخصبة أو تالفة ، وإخضاع جميع الأجنة المتبقية على 28،5 درجة مئوية.
5. بعد 24 ساعة ، واستخدام المجهر الفلورسنت تشريح لتحديد الأجنة الزرد التي لديها مستوى عال من GFP (البشرة) وRFP مضان (أكتين). وضع الأجنة في المختارة 28.5 درجة مئوية حتى جاهزة للشروع في العلاج الدوائي للحث على موت الخلايا المبرمج.

2. تحريض النتوء خلية في يرقات اسماك الزرد باستخدام G418

لقد وجدنا أن التعرض للمضادات الحيوية أمينوغليكوزيد G418 ، أو Geneticin ، وأسباب موت الخلايا المبرمج وقذف خلايا البشرة في وضع اليرقات الزرد ³ عبر آليات غير معروفة. الأهم من ذلك ، هذا العلاج يعمل فقط على اليرقات التي هي 4 أيام آخر الإخصاب وكبار السن. فإننا نجد أنه يمكن العثور على خلايا ~ 25/05 البثق في أي وقت من الأوقات من زعنفة الظهارية من الزرد G418 اليرقات المعالجة. وكمية الخلايا أفكارك البثق يمكن أن تختلف من الأسماك بالصيد ، نوصي تصاعد الأسماك متعددة للتصوير.

1. جمع ومكان آخر التسميد 4 يوم (DPF) يرقات الزرد العارضة كلا GFP ومضان RFP في صحن × 35 10MM الثقافة التي تحتوي على 3 مل (MLS) من E3. يمكن للمرء أن علاج ما يصل إلى 25 في هذه اليرقات حجم الطبق الثقافة.
2. استبدال بعناية مع وسائل الإعلام من 3mLs E3 1mg/mL تحتوي على يرقات واحتضان G418 في المخدرات لمدة 4 ساعات على 28،5 درجة مئوية. علما بأن G418 هو الضوء الحساسة ، حتى تأخذ الرعاية للحفاظ على طبق الثقافة مغطاة أو في الظلام.
3. إزالة وسائل الإعلام واستبدالها قبل تحسنت 28.5 ° C تحتوي على وسائل الاعلام E3 Tricaine 0.02 ٪ ، والشروع في تركيب اليرقات.

3. تصاعد يرقات اسماك الزرد للتصوير

1. 3 نقل اليرقات إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف وإزالة معظم E3 بعد غرق الأسماك إلى قاع الأنبوب. لقد وجدنا أن يمكن أن تصل إلى 3 الحيوانات شنت بشكل صحيح قبل agarose يتصلب.
2. تلميح باستخدام الماصة قطع ، 120ul الماصة من 1 ٪ LM - agarose (42 درجة مئوية) في أنبوب المزيج ، ثم الماصة بلطف واليرقات على خليط من agarose ساترة في قعر طبق الثقافة ماتيك.
3. استخدام حامل FST دبوس دبوس مع ادخال ابرة او التنغستن المرفقة ، بسرعة توجيه اليرقات بحيث تكون مستقيمة وثابتة ضد ساترة للطبق ماتيك.
   ملاحظة : نحن نستخدم عادة دبوس على التوالي لتوجيه أول اليرقات وبعد ذلك يعلقون على شكل حرف L لضمان أن تكون مسطحة ضد ساترة ، بينما منع الأضرار التي لحقت العينات.
4. مرة واحدة في agarose وقد عززت ، وملء الطبق برفق مع E3 تحتوي على 0.02 ٪ Tricaine. ملاحظة : بدلا من ذلك ، يمكن أن تضاف إلى E3 G418 في صحن التصوير على مواصلة حمل قذف ، على الرغم من التعرض الطويل الأمد للG418 1mg/mL سوف تقتل اليرقات.

4. يعيش تصوير حيوية أكتين الفردية والسلوكيات الخلايا الظهارية خلال النتوء خلية باستخدام مجهر القرص غزل متحد البؤر

لقد وجدنا أن العملية برمتها من قذف الخلية أفكارك من البشرة من يرقات النامية الزرد يستغرق نحو 20 دقيقة ^3. نحن هنا لشرح كيفية الإعداد تجربة تصوير مرور الزمن لجمع سلسلة من الطائرات ض من خلال طبقة واحدة من البشرة الزرد لتصور عملية قذف. لقد وجدنا أن المجاهر نموذجية widefield الفلورسنت photobleaching سببا هاما من خيوط الأكتين وعدم السماح للتصوير timelapse. لذلك ، لتحقيق أقصى قدر من قرارنا ومنع photobleaching ، ونحن نستخدم المجهر القرص الغزل مبائر. أدناه ونحن تصف كيفية إعداد التجربة باستخدام برنامج الذكاء Andor مع نيكون المجهر ، على الرغم من أنه يمكن تطبيق هذه المبادئ لمناقشة المجهر مجموعة عمليات مماثلة.

1. أولا ، بدوره على الأرجون (لاستثارة GFP في 488nm) وHeNe (لاستثارة RFP في 561nm) ليزر ، المجهر ، وكاميرا ومصباح epifluorescent.
2. ضمن برامج الذكاء Andor (الإصدار 1.10.1) ، بروتوكول إنشاء سلسلة زمنية تحتوي على موجات تريد صورة ، يجب أن تواتر الفترات الفاصلة بين يلتقط الصورة وعدد مرات تكرارها في الالتقاط.
3. بلطف مكان الطبق ماتيك تحتوي العينة على المسرح الخاص واستخدام المجهر هدفا 20X مع الضوء ينتقل إلى التركيز على اليرقات.
4. نقل مياه الغمر 40X الهدف (NA 0.8) في الموضع الصحيح. باستخدام هذا الهدف ، نستطيع أن الفيلم ما يقرب من 20-25 في مجال الخلايا ، والتي تسمح لنا لمتابعة السلوكيات الخلوي أثناء قذف في حين حل أيضا ديناميات الأكتين الفرعية الخلوية. ملاحظة : تصاعد نفسه ، ويمكن تطبيق استراتيجيات التصوير المجاهر لتستقيم ، على الرغم من يجب استخدام الغمر بالماء 40X موضوعية مع مسافة طويلة في العمل.
5. المكان بعناية قطرة من الماء على الجزء العلوي من الهدف بسرعة 40X ومكان الطبق ماتيك على القمة. ليسه : يمكن أيضا حل زايس الغمر Immersol ان تستخدم اذا كان تبخر الماء هو المشكلة.
6. تحديد العينة باستخدام المرحلة أو إنارة مدينة دبي للإنترنت واستخدام ثم epifluorescence 488nm إلى التركيز تحديدا على البشرة GFP إيجابية.
7. التبديل إلى وضع المسح مبائر. ضبط كثافة الليزر وزمن التعرض لكل من القنوات (488nm 561nm و) تبعا لذلك. الحرص على تحقيق التوازن في السلطة ليزر ووقت التعرض للكشف الأمثل للإشارة ، ومنع أي photobleaching أو سمية.
8. لتحديد الخلايا البثق ، استخدم epifluorescence لتصور GFP المسمى البشرة وتحديد مجموعة من الخلايا في نمط ريدة الكلاسيكية ، والتي تتكون من مجموعة من الخلايا المحيطة زنزانة صغيرة مستديرة في وسطها. باستخدام مبائر وضع المسح الضوئي ، وينبغي أن يكون هناك أيضا تراكم أكتين RFP المسمى مرئية كما حلقة حول الخلية جولة صغيرة في الوسط ، وهي السمة المميزة للقذف الخلية. ذات مرة كنت قد حددت خلية البثق والمسارعة لتشكيل لاكتساب المجهر 4D (XYZ وقت) مبائر قواعد البيانات.
9. تعيين نقطة العلوي والسفلي داخل الطائرة ض لتصور طبقة واحدة من البشرة ، بما في ذلك خلية البثق ، وحدد حجم الخطوة. لمرور الوقت مجموعة التصوير ، وفترات لالتقاط الصور وعدد من التكرار. على سبيل المثال ، فإننا عادة ما يكون الحصول على سلسلة Z - 5 - 10μm الممتدة ، مع حجم ميكرون الخطوة 1 ، كل دقيقة 1-2 لمدة 30 دقيقة.
10. لعرض البيانات ، ونحن جعل عادة 3 - D التوقعات من سلسلة z وحفظ البيانات على النحو ملف الفيلم متوافق مع الزمن السريع (أبل). بهذه الطريقة ، يمكننا تصور تقلص حلقة أكتين الظهارية والسلوكيات التي تحدث في جميع أنحاء الخلية تموت مع مرور الوقت.

5. ممثل النتائج

الشكل 1. تخطيطي للقذف الخلية أفكارك. وتظهر خيوط الأكتين في الحمراء ، وخلايا البشرة GFP الإيجابية الأخضر.

الشكل 2. التجريبية سير العمل. ألف تخطيطي لسير العمل في التجربة. باء. التعبير عن RFP - UtrCH في البشرة من CK 4dpf : GFP الزرد.

الشكل 3. ومع الإطارات (Z - إسقاطات) من فيلم مرور الزمن الذي يلي يعيش أكتين ديناميكية أثناء عملية قذف الخلايا الظهارية. الأسهم تدل على حلقة الأكتين التي شكلتها الخلايا المجاورة التي العقود ويغلق على مدار 2 دقيقة.

Discussion

بروتوكول الموصوفة هنا يوضح طريقة بسيطة ومباشرة لتصور عملية البثق في منديل الظهارية حية. هذا النوع من التجربة تسمح لنا دراسة ديناميات أكتين الدقيقة لا تقدر سابقا في تحليل الأنسجة الثابتة ، وبالتالي يكمل أساليب مناعي مشترك. يمكننا استخدام هذا البروتوكول في تركيبة مع مثبطات الكيميائية أو طفرات وراثية لتحسين تحليل عملية السحب والحالات المرضية المرتبطة دراسة الفشل واضحة لإزالة الخلايا أفكارك ، والتي نتوقع أن يؤدي إلى استجابات التهابية أو تراكم الخلايا التالفة ، كما ينظر في مرض السرطان....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم	نوع	شركة	رقم كتالوج	تعليقات
RNeasy ميني كيت	الكاشف	Qiagen	74104
mMessage mMachine SP6 كيت	الكاشف	Ambion	AM1340
عبور الدبابات	أداة	Thoren الأنظمة المائية
والمضخة الماصة	أداة	منتجات بيل فنون	F3789
5 ¾ باستور الماصة	أداة	VWR	14672-608
Microinjection مقلب	أداة	أدوات التكيف العلوم	I - 34
100x15mm الثقافة بلايت	أداة	الصياد	08-757-12
Flamming / براون Micropipet بولير	أداة	سوتر آلات الشركة	نموذج P97
زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية مع الشعيرة	أداة	سوتر آلات الشركة	B1400 - 78-10	OD 1.0mm ، ID 0.78mm ، وطول 10cm
جرة التخزين الكهربائي	أداة	العالم آلات دقيقة	E210
الفينول الأحمر	الكاشف	سيغما	P0290	0.5 ٪ في DPBS
الضغط والتحكم Microinjector Micromanipulator	أداة	جهاز هارفارد	PLI - 100
35x10mm الثقافة الطبق	أداة	Cellstar	627-160
G418 (Geneticin)	الكاشف	GIBCO	10131-035	50 ملغ / مل في DH 2 0
دومون # 5 الملقط	أداة	أدوات العلوم غرامة	11253-20
12cm حامل الدبوس	أداة	أدوات العلوم غرامة	26016-12
إدراج دبابيس	أداة	أدوات العلوم غرامة	26007-02 و- 03
صحن زجاج الثقافة القاع مع 1.5 ساترة	أداة	ماتيك	P35G - 1.5 - 10 - C
انخفاض تذوب Agarose	الكاشف	الصياد	BP1360 - 100
Tricaine	الكاشف	سيغما	A - 5040
تشريح مجهر	مجهر	لايكا	MZ6
تشريح مجهر	مجهر	نيكون	SMZ645
فلوري مجهر تشريح	مجهر	اوليمبوس	S2X12
الغزل القرص مجهر متحد البؤر	مجهر	نيكون	كسوف تي	تجهيزه مع قرص Yokagawa رئيس الغزل
كاميرا CCD	كاميرا	Andor	DV - 885 - VP	1002x1004x8 ميكرون مربع بكسل