Method Article

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

DOI:

10.3791/2689

⸱

June 27th, 2011

 , 
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا الموت تنبثق من الأنسجة الطلائية التي تقلص متضافرة من الخلايا المجاورة دون تعطيل وظيفة الحاجز. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف أساليب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات في القرار الخلوية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استتبابي صيانة الأنسجة الطلائية المستمر يتطلب إزالة الخلايا التالفة من دون تعطيل وظيفة الحاجز. ووصف عملية دراستنا وجدنا أن الخلايا الميتة إرسال إشارات إلى جيرانهم العيش في تشكيل وعقد حلقة من الأكتين والميوسين التي يقذف بها من ورقة الظهارية في حين إغلاق أي ثغرات يمكن أن تكون قد نتجت عن خروجها ، قذف الخلية 1. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف الأسلوب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات. لتصور البثق ، ونحن حقن بروتين فلوري الأحمر المسبار المسمى لأكتين F - الأجنة في مرحلة واحدة خلايا معدلة وراثيا الزرد التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء في البشرة ويحفز موت الخلايا المبرمج عن طريق إضافة إلى G418 اليرقات. ثم نستخدم الوقت الفاصل بين التصوير على القرص الغزل مبائر المجهر لمراقبة ديناميات أكتين والسلوكيات الخلايا الظهارية أثناء عملية قذف الخلية أفكارك. هذا الأسلوب يتيح لنا للتحقيق في عملية قذف في ظهائر العيش وسوف توفر وسيلة لدراسة الحالات المرضية الناجمة عن الفشل في القضاء على الخلايا أفكارك.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأساسية لسير العمل في التصور من خلال حيوية أكتين النتوء خلية في البشرة من اسماك الزرد النامية

وتتألف البشرة من الزرد النامية من طبقتين متميزة ، الطبقة السطحية (أو محيط بالأدمة) وطبقة من الخلايا القاعدية التي تتصل الغشاء القاعدي 2. خلايا طبقة السطح الخارجي يخضع موت الخلايا المبرمج ويتم التخلص من النسيج بواسطة البثق 3 (الشكل 1). تصور هذه العملية في الوقت الحقيقي ، ونحن حقن البروتين RNA أحمر فلوري ترميز تنصهر إلى المجال للتناظر calponin utrophin ، وهو بروتين ملزمة أكتين (RFP - UtrCH) 4،5 ، في خلية واحدة ، معربا عن ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول الموصوفة هنا يوضح طريقة بسيطة ومباشرة لتصور عملية البثق في منديل الظهارية حية. هذا النوع من التجربة تسمح لنا دراسة ديناميات أكتين الدقيقة لا تقدر سابقا في تحليل الأنسجة الثابتة ، وبالتالي يكمل أساليب مناعي مشترك. يمكننا استخدام هذا البروتوكول في تركيبة مع مثبطات الكيميائية أو طفرات وراثية لتحسين تحليل عملية السحب والحالات المرضية المرتبطة دراسة الفشل واضحة لإزالة الخلايا أفكارك ، والتي نتوقع أن يؤدي إلى استجابات التهابية أو تراكم الخلايا التالفة ، كما ينظر في مرض السرطان........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رعاية الحيوان ضمان

وقد تمت الموافقة على تنفيذ جميع الإجراءات في هذا البروتوكول باستخدام الزرد ، دانيو rerio ، عن طريق رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (IACUC) في جامعة ولاية يوتا (ضمان رعاية الحيوان # 10-07017).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء روزنبلات المختبر العلمي للمناقشات والاقتراحات والتعليقات. نود أيضا أن نشكر الذين قدموا ماري هالوران يرجى الترميز البلازميد RFP - UtrCH وجرونوالد ديفيد الذي قدم CK : GFP الزرد المعدلة وراثيا. أيضا بفضل جريتشين الملك وموظفي الموارد اسماك الزرد المركزية في جامعة ولاية يوتا لصيانة ممتازة ورعاية الزرد. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، جائزة NIGMS NIH المدير الجديد المبتكر 1 DP2 OD002056 - 01 إلى JR. كان مدعوما من قبل GTE التدريب NIH السرطان المتعدد التخصصات 5T32 برنامج منح CA03247 - 8.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
اسم نوع شركة رقم كتالوج تعليقات
RNeasy ميني كيت الكاشف Qiagen 74104
mMessage mMachine SP6 كيت الكاشف Ambion AM1340
عبور الدبابات أداة Thoren الأنظمة المائية
والمضخة الماصة أداة منتجات بيل فنون F3789
5 ¾ باستور الماصة أداة VWR 14672-608
Microinjection مقلب أداة أدوات التكيف العلوم I - 34
100x15mm الثقافة بلايت أداة الصياد 08-757-12
Flamming / براون Micropipet بولير أداة سوتر آلات الشركة نموذج P97
زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية مع الشعيرة أداة سوتر آلات الشركة B1400 - 78-10 OD 1.0mm ، ID 0.78mm ، وطول 10cm
جرة التخزين الكهربائي أداة العالم آلات دقيقة E210
الفينول الأحمر الكاشف سيغما P0290 0.5 ٪ في DPBS
الضغط والتحكم Microinjector Micromanipulator أداة جهاز هارفارد PLI - 100
35x10mm الثقافة الطبق أداة Cellstar 627-160
G418 (Geneticin) الكاشف GIBCO 10131-035 50 ملغ / مل في DH 2 0
دومون # 5 الملقط أداة أدوات العلوم غرامة 11253-20
12cm حامل الدبوس أداة أدوات العلوم غرامة 26016-12
إدراج دبابيس أداة أدوات العلوم غرامة 26007-02 و- 03
صحن زجاج الثقافة القاع مع 1.5 ساترة أداة ماتيك P35G - 1.5 - 10 - C
انخفاض تذوب Agarose الكاشف الصياد BP1360 - 100
Tricaine الكاشف سيغما A - 5040
تشريح مجهر مجهر لايكا MZ6
تشريح مجهر مجهر نيكون SMZ645
فلوري مجهر تشريح مجهر اوليمبوس S2X12
الغزل القرص مجهر متحد البؤر مجهر نيكون كسوف تي تجهيزه مع قرص Yokagawa رئيس الغزل
كاميرا CCD كاميرا Andor DV - 885 - VP 1002x1004x8 ميكرون مربع بكسل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
  2. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell ExtrusionZebrafish EpidermisActin DynamicsSpinning Disc ConfocalTime lapse ImagingApoptotic Cell RemovalGFP RFP LabelingG418 Induced ApoptosisEpidermal Barrier FunctionLive Tissue Imaging

Related Articles