$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
في هذا البروتوكول نظهر معزولة ، التهوية ، الرئة الماوس perfused التحضير الذي سبق استخدامه لقياس أثر الصمات الرئوية المزمنة ونقص الأكسجين في نابض الضغط الرئوي العلاقات تدفق الأوعية الدموية (Tuchscherer ، ويبستر ، وChesler ، 2006 ؛ Tuchscherer وآخرون ، 2007). باختصار ، يتم عزل جراحيا الرئتين الماوس من الأنسجة المحيطة بها ، وضعت في غرفة ساخنة (IL - 1 ؛ جهاز هارفارد ، Holliston ، MA) والتهوية (التنفس الصناعي وحدة التحكم (VCM) - R مع وحدة مكافحة الموقت (TCM) وجامعة هارفرد جهاز). هو perfused الأوعية الدموية الرئوية ساخنة مع RPMI 1640 خلية متوسطة الثقافة مع Ficoll 3.5 ٪ باستخدام مضخة محقنة (كول ، Parmer ، فيرنون هيلز ، IL) لتوليد التدفق المطرد الطول الموجي أو مضخة متذبذبة عالية التردد (بوس الكهربائية القوة ، عدن المرج ، MN) بالتوازي مع ضخ حقنة لإنشاء الأوعية الدموية الرئوية نابض تدفق الموجات. محولات الضغط (P75 جهاز هارفارد) قياس لحظية ضغط الشريان الرئوي (PAP) والضغط الأذيني الأيسر (LAP). ويتم قياس معدل التدفق الفوري (س) مع تدفق متر في خط مستقيم (أسرع من الصوت سيستمز ، إيثاكا ، نيويورك). وتستمد نابض ضغط التدفق من علاقات هذه القياسات ، والتي توفر نظرة ثاقبة علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الوعائية الرئوية والحق حمولة تلوية البطين.
1. المعدات :
- عزل الرئة بما في ذلك انشاء جهاز التنفس الصناعي الماوس
- بيانات نظام حيازة والكمبيوتر مع برنامج LABVIEW
- محولات الضغط اثنين ومقياس الجريان لتدفق سائل الإرواء
- محول الضغط ومقياس الجريان (pnemotachometer) لتدفق مجرى الهواء
- مضخة عالية التردد متذبذبة والكمبيوتر مع برنامج اختبار وين
- الطفرة / التكبير مجهر ، مصباح
- حمام التدفئة مع ارتفاع الناتج عن مضخة IL - 1 نظام
2. إعداد نظام IL - 1
- تسخين الماء المقطر إلى 37 درجة مئوية بحلول حمام التدفئة وتعمم في المناطق الداخلية من نظام IL - 1.
- وترتبط جميع المضخات ومحولات الطاقة وIL - 1 قنية عبر أنابيب نظيفة ويتم مسح جميع الأنابيب بالماء المقطر تسخينها إلى 37 درجة مئوية. يجب إزالة فقاعات الهواء ، والتي يمكن السفر في الرئة وتسبب وذمة. يتم مسح أنابيب من المضخة تدفق متذبذبة لاستشعار التدفق والاستشعار من تدفق للقنية الشريان الرئوي مع PBS 1 ٪.
- وركزت على محولات الضغط P75 بواسطة إغلاق صمام للقنية ، وفتح الصمامات في الغلاف الجوي ومن ثم الضغط على زر التلقائي صفر على مكبر للصوت PLUGSYS. ثم ، يتم إغلاق صمام في الغلاف الجوي وفتح صمام للقنية.
- هو قطعة من السيراميك المبللة مسامية في مسار نظام تهوية IL - 1 لتوفير الرطوبة.
3. الحلول
- تعد 3،5 ٪ بحلول حل Ficoll - RPMI حجم وتصفية العقيمة وسائل الإعلام. تصفية وسائل الإعلام يضمن عدم وجود الجزيئات الكبيرة التي يمكن أن embolize عن غير قصد في الرئة. باستخدام وسائل معقم يقلل أيضا من احتمال وذمة المفاجئ النامية في الرئة. حقنة ملء واحدة مع 10 مل RPMI لعملية جراحية واحدة 60 مل مع محقنة RPMI لكل محاكمة التجريبية. تسخين سائل الإرواء في حمام ماء C ° 37.
- إعداد 1ml من وزن الجسم الهيبارين 500IU/100g من الفأرة (تقريبي). الملح الهيبارين 158IU/mg. للماوس ~ ز 25 ، مزيج من الملح 1.25 ملغ الهيبارين مع الحل PBS 1ml في أنبوب microcentrifuge الصغيرة.
4. التهوية ماوس
- بعد الحقن داخل الصفاق من 150 ملغ في بنتوباربيتال حل للكيلوغرام الواحد في الماوس ، وضمان التخدير العميق عن طريق إجراء قرصة الثابت على مخلب. إذا لم يكن هناك رد فعل ، وإعداد الماوس لإجراء عملية جراحية من قبل الكفوف يعلق على صدر صفحتها الأولى corkboard للاستقرار. ويتم رصد هذه التجربة طوال مخدر العمق من خلال مراقبة بعناية الحيوانية : المذكرة. دبابيس في الكفوف وشقوق متكررة بمثابة محفزات المؤذية ، وعدم الاستجابة لمما يؤكد أن هذا الحيوان لا يزال في الطائرة من التخدير الجراحي.
- رش الصدر مع الكحول 95 ٪ إلى أسفل الرطب الفراء واستخدام الملقط مباشرة الى الاستيلاء على الجلد في الرقبة. قطع 1 سم فتحة في الجلد باستخدام المقص مباشرة.
- مرة واحدة يتعرض لها داخل الرقبة ، وإزالة جميع الأنسجة والعضلات غدي بيضاء سطحية ، وتبحث عن المريء والقصبة الهوائية. عزل والقصبة الهوائية والمريء من النسيج على كلا الجانبين والخلف.
- إدراج عازمة ملقط صغير تحت القصبة الهوائية والاستيلاء على قطعة من الخيط على الجانب الآخر. سحب الدرز تحت القصبة الهوائية وربطة عنق عقدة الجراحين فضفاضة. لا تشديد خياطة أو ربط عقدة.
- قطع صغيرة الزاوية "V" في القصبة الهوائية مع مقص صغير ، لا قطع كل الطريق من خلال القصبة الهوائية. تحرك مجلس الفلين والفأر إلى IL - 1 نظام تدفئة. باستخدام الملقط two حادة ، والاستيلاء على قنية القصبة الهوائية والقصبة الهوائية أسفل "V". ثم ، حرك قنية في القصبة الهوائية trachعصام من خلال فتح "V". تشديد خياطة حول القصبة الهوائية وقنية القصبة الهوائية لتأمين قنية داخل القصبة الهوائية. يعقدا قرانهما.
- تبدأ التهوية (50 ٪ إلهام و 90 نفسا / دقيقة ، مع إلهام عميق) مع هواء الغرفة.
5. Perfusing ماوس مهواة
5.1. الوصول إلى البطين الأيمن لحقن الهيبارين
- رذاذ الصدر الفأر مع الكحول مرة أخرى لإعادة الرطب الفراء. إزالة كافة الجلد على صدره فوق الأضلاع باستخدام ملقط ومقص مباشرة مستقيمة. قطع التصاعدي على طول القص. رفع الجلد على كل جانب ثم قص الجلد بعد السطر السفلي الأضلاع.
- فهم عملية الخنجري في الجزء السفلي من عظمة القص مع ملاقط وقطع ثقب في الحجاب الحاجز باستخدام المقص مباشرة. الاستيلاء على الحجاب الحاجز مع ملاقط وقطع عليه بعيدا عن ضلوعه.
- فهم عملية الخنجري مرة أخرى مع ملاقط (اليد اليسرى) ، واستخدام غيض الكرة ، مقص الزاوية لخفض ما يصل من خلال القص والاضلاع ، والحرص على عدم قطع الرئتين والقلب أو في الأوعية الدموية (استخدام الكرة على الحافة المقص لإرشادك). وسوف يكون هناك دم ولكن طالما طليعة المقص هو ضد القص ، لن تقطع القلب والرئتين يكون.
- فهم أضلاعه على الجانب الأيسر وقطع بعيدا قدر من أضلاعه اللازمة لكشف القلب. ضخ البطين الأيمن ببطء بنسبة 0.1 مل حل الهيبارين. هذه الخطوة مهمة لمنع الجلطات الدموية في الرئة ، والتي تلف الخلايا البطانية وسوف يضعف التروية. يجب حقن الهيبارين بينما القلب لا يزال الضرب.
5.2. يقني ؛ يدخل القنية الشريان الرئوي الرئيسي
- قطع بعيدا بقية الاضلاع (الجانب الأيمن والأيسر) باستخدام الظهر (تقريبي) نهاية ملقط لدفع برفق الرئتين بعيدا عن الجدار الصدري. الاستيلاء على الرئتين وتلف الأنسجة نفسها الحساسة. سوف اتصل عرضية بين مقص نصائح وأنسجة الرئة أيضا أن يسبب الضرر.
- نقل المجهر في مكانه أكثر من الرئة. قطع الأنسجة الدهنية والغدد فوق القلب. استخدام ملاقط لتسحبه بعيدا عن الشرايين والأوردة وثم قطع مع مقص في الربيع في حين الأنسجة في التوتر.
- باستخدام مجموعة أخرى من كليلة ملاقط ، مغرفة من اليمين إلى اليسار من أعلى القلب تحت الأذين الأيسر / البطين للحصول على غيض من ملاقط تحت الشريان الأورطي والشريان الرئوي (السلطة الفلسطينية). القيام بذلك بعناية يجب ألا تكون هناك مقاومة للملاقط. باستخدام الملقط حادة يقلل من احتمال حدوث ثقب عن طريق الخطأ في الشريان الرئوي أو الشريان الأورطي.
- مرة واحدة في تلميح منتاش تحت الأبهر والسلطة الفلسطينية ، والاستيلاء على قطعة من الخيط والجذب من خلال. عقدة التعادل الجراحين فضفاضة. لا تشديد خياطة أو ربط عقدة.
- اختياري : استخدم المقص لإزالة الزاوية النصف السفلي من الجسم. خفض من خلال الضلوع والعمود الفقري ؛ قطع الشريان الأورطي ، والوريد الأجوف يؤدي إلى كمية كبيرة من الدم في التدفق -- استخدام Q - تلميح لكبح تدفقها. مكان في كيس للتخلص منها.
- رئيس السلطة الفلسطينية قنية مع 4 مل من حقنة 10 مل من RPMI. المزدوج تحقق من أن جميع الأنابيب خالية من فقاعات الهواء. ونضح من الرئة مع الماء المقطر أو فقاعات النتيجة في ذمة.
- قطع الشق الصغير في جدار البطين الأيمن حرة وإدراج قنية السلطة الفلسطينية ، وتهدف إلى الأسفل وإلى اليمين. ينبغي غيض من قنية تكون مرئية من خلال الجدار شفافة للسلطة الفلسطينية. ضخ كمية صغيرة من RPMI لتأكيد الموقع الخاص بك. تشديد خياطة حول الأبهر ، قنية والسلطة الفلسطينية وربط عقدة. لاحظ أنه عند هذه النقطة ، يرتبط أيضا الأبهر قبالة حتى نضح الفعلي لا ينبغي أن تبدأ حتى يتم مقنى الأذين الأيسر.
5.3. يقني ؛ يدخل القنية الأذين الأيسر
- قطع الثلمة في الجزء السفلي من البطين الأيسر والأذين الأيسر خامل قنية (لوس انجليس) ، وتهدف إلى أعلى. قد تكون هناك حاجة إلى ضغط طفيف لفتح صمام تاجي في هذا الاتجاه. في الموقع الصحيح ، سوف تفلت من طرف قنية وتكون آمنة من دون خياطة.
5.4. يبدأ نضح
- ضخ يدويا RPMI من الحقنة 10 مل في 0.3 مل في الدقيقة الواحدة حتى RMPI هو واضح في أنابيب تدفق (وردي اللون في العش على النقيض من برنامج تلفزيوني واضح). إذا لم يكن هناك تدفق في تدفق الأنابيب ، والموقف من جديد في قنية لوس انجليس. إذا كان من الممكن الحصول على أي تدفق مع إعادة تحديد المواقع ، التحقق من وجود تسرب في الشريان الرئوي. لا يمكن حدوث تسرب أو تمزق في الشريان الرئوي يمكن إصلاحه ، وهذا هو سبب لإجهاض التجربة.
- الاتصال حقنة 60 مل إلى قنية السلطة الفلسطينية من خلال نظام IL - 1 وبدء ضخ 1ml/min من سائل الإرواء ، والتحقق من التسرب ، والتأكد من الرئتين بدوره البيض ، مما يدل على ان يتم استبدال RPMI الدم في الرئتين. يروي مع التدفق البطيء لمدة دقيقتين.
6. نابض وقياس الضغط الرئوي ثابت التدفق العلاقات
- لدراسات تدفق نابض ، أولا تعيين مكبس المضخة متذبذبة في تشريدالمستويات المنشودة لكل تردد في WinTest برنامج يقوم على التجارب السابقة. بسبب التباين في بنية الرئة والميكانيكا ، والتشريد لا بد من تعديلها لكل الماوس. ضبط تدفق مستمر للمستوى المطلوب. فتح صمام المضخة متذبذبة وبدء تسجيل البيانات الحق قبل تشغيل ملف تدفق متذبذبة (Wintest البرنامج). فتح ملف البيانات والحبكة تدفق التجريبية (س) في Excel. ضبط مكبس المضخة متذبذبة التشريد في كل الترددات (Wintest البرنامج) بحيث يتم على النحو المرغوب فيه والحد الأقصى س س.
- تدفق مستمر للمحاكمات ، وأغلق صمام المضخة متذبذبة. إذا ترك هذا صمام فتح ، المضخة متذبذبة بمثابة مكثف ، الملطف التغييرات من معدل التدفق واحد إلى آخر. جمع بيانات عن ما لا يقل عن 10 ثانية في كل معدل التدفق أو حتى ضغط السلطة الفلسطينية لا يتغير بأكثر من 5 ٪.
- لقياس تدفق نابض إما ثابتة أو والتهوية القديمة في الضغط المستمر من قبل جمع البيانات. استئناف التهوية مباشرة بعد جمع البيانات.
- مراقبة RPMI في أنابيب التنفس ، وهذا دليل على ذمة ومدعاة للإحباط التجربة. أيضا ، لا تدع RPMI تصل إلى الضغط الهوائي أو أجهزة استشعار التدفق لأنها سوف تضر محولات الطاقة.
7. ممثل النتائج :
نتائج ممثل ثابت :
في الرئة معزولة انشاء المجرب لديه القدرة على التحكم بشكل مستقل ليس فقط في الرئة ولكن أيضا س تدفق مجرى الهواء ضغط الهواء وترك ف LAP الضغط الأذيني. هذا هو مفيد لأنه س ، ف الهواء والتأثير على الأوعية الدموية LAP الرئوي وما نتج عنه من ضغط الشريان الرئوي PAP. ميزة أخرى هي أن النتائج التي تم الحصول عليها مستقلة عن الجهاز العصبي نبرة متعاطفة 1 ، حالة وحدة التخزين ، والتخدير 2.
وتظهر التغييرات التي تحدثها PAP درج خطوة التغيرات في الهواء لف س الثابتة والثابتة أو متفاوتة LAP في الشكل 1. علما بأن في إعداد الرئة معزولة ، ويرتبط عادة قنية LAP لأنابيب أن يوجه سائل الإرواء في حاوية النفايات. مع هذه الأنابيب في مكانها ، LAP يعتمد على سؤال خطي بسبب تدفق Poiseuille. ومع ذلك ، يمكن أن يكون ارتفاع مأخذ حاوية النفايات وضبطها يدويا لتوفير ثابت وغير صفرية أو LAP يمكن إزالة أنابيب للسماح صفر LAP أن يكون مستقلا عن Q.
نابض ممثل النتائج :
في حين يمكن أن تتولد التعسفي نابض تدفق الموجات مع هذا النظام ، ونحن عادة توليد تدفق شكل س = 3 + 2 الخطيئة (2 و πt) مل / دقيقة على الترددات من هرتز = 1 ، 2 ، 5 ، 10 ، 15 و 20 و لتقييم مقاومة خطي من الأوعية الدموية الرئوية (الشكل 2 : اللوحة العلوية). من القياسات PAP ، LAP وس الناتجة عن ذلك ، يتم حساب حجم مقاومة الأوعية الدموية الرئوية (Z) والمرحلة (θ) متحللة من جانب أول دورة واحدة كاملة من الجيبية = ΔP LAP - PAP وفرضت على كل سؤال الجيبية معدل تدفق التردد في سلسلة من التوافقيات الجيبية باستخدام تحويل فورييه. نسبة الضغط لتحويل تدفق عائدات تحويل مقاومة vascualar الرئوي ، PVZ = FFT (ΔP) / الاتحاد الفرنسي للتنس (س) ، الذي Z حجم ومرحلة θ. وتحسب مساهمة المعاوقة Z 0 ، خاصية مقاومة C Z ، ومؤشر انعكاس موجة R W ، من حجم مقاومة. على وجه الخصوص ، ويحسب من Z Z 0 في 0 التوافقي (و هرتز = 0) في المتوسط على جميع الترددات ، ويحسب Z C ومتوسط Z بين الحد الأدنى الأول (5 هرتز) ، وهرتز 20 ، ويتم احتساب R W ك (Z - Z 0 C) / (Z Z C 0 +) 3.

الشكل 1 تدفق ثابت الطول الموجي (الصف العلوي) ، والضغوط الناجمة عن ذلك. (الصف الثاني : PAP ، ف الهواء ، LAP) بوصفها وظيفة من الوقت مع مجموعات مختلفة من LAP والهواء ف. الصف السفلي يظهر PAP مقابل م في الفقرة (أ) و (B) ، ويزيد وينقص مع LAP س لأن أنابيب تدفق كان في المكان. تمت إزالة هذه الأنابيب ل(C) بحيث LAP هو ثابت ومستقل م في (د) و (E) تم تعديل ارتفاع أنابيب منفذ يدويا بحيث LAP هو أعلى ولكن مستقلة عن م ف الهواء وإما في نهاية الشهيق (A ، C ، D) أو نهاية الزفير ، (B ، E) الضغط.

الشكل 2 تدفق نابض الموجي س (اللوحة العلوية) والضغوط الناجمة عن ذلك (اللوحة السفلية : PAP ، LAP والهواء P). بوصفها وظيفة من الزمن. من هذه العلاقات للضغط تدفق نابض الرئوي ، يمكن حساب PVZ ، الأمر الذي يعكس إجمالي حمولة تلوية البطين الأيمن.