في هذا الفيديو ، ونحن تصف طريقة لتصوير الخلايا الحية لتقسيم الخلايا الاصلية غير متماثلة الحسية والجهاز سليمة في خلايا البشرة ذبابة الفاكهة الشرانق
مقالة منهجية
تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
منذ اكتشاف بروتين الفلورية الخضراء (GFP) ، كان هناك تغير ثوري في استخدام التصوير الخلية الحية كأداة لفهم الآليات البيولوجية الأساسية. وقد ضرب التقدم واضحا بشكل خاص في ذبابة الفاكهة ، التي واسعة من الأدوات المسوخ وخطوط المعدلة وراثيا تقدم نموذجا مناسبا لدراسة تطويريا - الحفظ الآليات البيولوجية التنموية والخلية. ونحن مهتمون في فهم الآليات التي تحكم مواصفات مصير الخلية في نظام أخلاقي العصبي الطرفي (المحيطي) في ذبابة الفاكهة. الشعر الخشن الذي يغطي الرأس والصدر والبطن والساقين وأجنحة تطير البالغين mechanosensory الأجهزة الفردية ، وكان قد درس كنظام نموذجا لفهم آليات نوتش التي تعتمد على قرارات مصير الخلية. ويتم توزيع الجهاز الحسي السلائف (سوب) خلايا microchaetes (أو شعيرات صغيرة) ، في جميع أنحاء ظهارة من القفص الصدري العذراء ، ويتم تحديده خلال الساعات ال 12 الأولى بعد ظهور pupariation. بعد مواصفات ، SOP تبدأ الخلايا على الانقسام ، الذي يحدد مصير عزل الخلايا خدران إلى الخلية أثناء الانقسام ابنة واحدة. خدر يعمل بمثابة مثبط خلية مستقلة تابعة لنوتش مسار الإشارات.
هنا ، وتبين لنا طريقة لمتابعة ديناميكية البروتين في الخلية وSOP ذرية في غضون الصدر والعذراء سليمة باستخدام مزيج من الأنسجة الخاصة Gal4 السائقين وGFP الموسومة 1،2 البروتينات الانصهار ، وهذا الأسلوب له ميزة على الأنسجة الثابتة أو مثقف explants لأنه يسمح لنا متابعة تطور جهازا بأكمله من مواصفات السلائف العصبية للنمو وتمايز محطة للجهاز. يمكننا بالتالي ترتبط مباشرة تغييرات في سلوك الخلية إلى تغييرات في التفريق المحطة. وعلاوة على ذلك ، يمكننا الجمع بين تقنية التصوير العيش مع تحليل الفسيفساء مع علامة الخلية repressible (MARCM) نظام لتقييم ديناميات بروتينات المفتاحية في إجراءات العمل الموحدة في ظل ظروف متحولة الإنقسامية أو wildtype. باستخدام هذه التقنية ، وقد كشفت لنا الرواية وغيرها من الأفكار في تنظيم انقسام الخلايا غير المتماثلة ومكافحة تفعيل الشق يشير في الخلايا سوب (الأمثلة تشمل إشارات 1-6،7 ، 8).
البروتوكول
المواد المطلوبة : تشريح ستيريو المجهر ، الشريط على الوجهين ، شريحة المجهر القياسية وساترة ، ملقط تشريح (حجم 5 أو 5.5) ، لينة ذات شعيرات الفرشاة ، سيليكون الشحوم فراغ ، حقنة 5cc ، ورقة Whatman ، أو مبائر epifluorescence المجهر مع الكاميرا الرقمية والصور اقتناء البرمجيات.
1. تشريح العذراء
- إعداد الصليب (باستخدام توليفة مناسبة من خط Gal4 والبروتين GFP الانصهار الموسومة تحت السيطرة UAS) أو الذباب مكان من الأسهم التي ترغب في الصورة في قوارير جديدة عدة عند 25 درجة مئوية.
- خلايا SOP عموما يبدأ تتكاثر على الصدر العذراء في ثمانية عشر ساعة بعد ظهور pupariation ، ولذلك قمنا باختيار "البيض" عذارى من المخزون المناسب أو عبر ذبابة. الشرانق بيضاء لها التشكل العذراء ، ولكن قضية شعر عديم الصبغة العذراء ، مشيرا إلى أنها قد pupariated في غضون ساعة.
- انتظر حوالي 18 ساعة.
- ضع قطعة من الشريط على الوجهين على الشريحة. جمع الشرانق والتمسك حالة العذراء إلى الشريط على الوجهين مع الجانب البطني أسفل. فهم على حافة الوصاد (الفتحة الدائرية على الحافة الأمامية الظهرية للقضية العذراء) مع ملقط
- برفق رفع وإزالة وتجاهل الوصاد ، وكشف رئيس الطيران غير ناضجة.
- استخدم ملقط لبدء تمزق على طول الجانب من القضية العذراء. رفع القسم الوسطي للقضية العذراء من الجانب ممزقة وجعله أكثر إلى الجانب الآخر ، إما إزالة تماما أو نعلق على الشريط ، وكشف عن الصدر والجزء الأمامي من البطن. ( ملاحظة : هناك فجوة بين البلدان النامية ويطير حالة العذراء. يجب الحرص على عدم ثقب يحدث تمزق في جدار ويطير في القضية.)
- قطع بيغن على طول نفس الجانب من القضية العذراء قرب نهاية الخلفي. مرة أخرى ، يجب الحرص على عدم ثقب الطيران. سحب القضية العذراء إلى الجانب الآخر من الطيران واضغط عليه على الشريط على الوجهين. وينبغي الآن أن يتعرض البطن بالكامل. مكان الفرشاة ذات شعيرات ناعمة مباشرة تحت رئيس الطيران. بمجرد عالق يطير إلى الفرشاة وخالية من حالة العذراء ، واستخدام الفرشاة بلطف لرفع حظر الطيران خارج الشريحة.
2. تركيب العذراء
وبعد التشريح ، هي التي شنت ثم الشرانق بين الشرائح وساترة :
- الشرانق المعزولة إزالتها من الأحوال أن توضع على مركز للزجاج الجانب الظهري الشريحة الأعلى.
- جعل الإطار مربع من الورق Whatman 18X18mm ترك 10X10 مم فتحة في الوسط. ورقة في الماء حتى تزج المشبعة. حول مكان الشرانق.
- استخدام حقنة مليئة 5 سم فراغ سيليكون الشحوم ، وتطبيق طبقة موحدة من الشحوم حول الإطار Whatman. ينبغي للطبقة الشحوم تدخل ضمن ساترة (الشكل 1) وسمك يجب أن يكون فقط قليلا أكبر من القطر العذراء.
- ضع قطرة ماء صغيرة (1 ميكرولتر) في وسط ساترة 22X22 مم ووضع ساترة على إعداد مثل أعلاه أن قطرة الماء الصغيرة اتصالات سطح تريد notum ، الصورة في هذه الحالة). ضغط برفق على شكل خاتم كاملة من الشحوم فراغ والمسطحة سطح التماس بين ساترة وبشرة العذراء.
- هل يمكن تصوير ثم الإعدادية في microcopes المقلوب أو تستقيم ، وذلك باستخدام إما epifluorecence ، مبائر (ليزر المسح أو الغزل نوع القرص) أو ثنائي الفوتون مبائر. إذا كنت حذرا ، يمكن استرداد الذباب الكبار بعد عدة أيام.
3. ممثل النتائج :
استخدام خط Gal4 SOP محددة ( neuralized - Gal4) عبروا إلى البروتينات GFP المفتاحية لتسمية المغزل الإنقسامية (تويولين أو تاو GFP) أو البروتينات هيستون (H2B - GFP) ، يمكن للمرء أن يلاحظ الطائرة تقسيم SOP انقسام الخلايا ، وطول دورة الخلية ، أو عدد الإنقسامية الانقسامات باستخدام الفاصل الزمني التصوير 9. بروتينات الاندماج الأخرى التي تستهدف العضيات الخلوية مثل الرب ، GTPases بمناسبة مقصورات التقامي مختلفة (Rab5 - GFP في أوائل الإندوسومات أو الإندوسومات Rab11 GFP لإعادة التدوير) أو البروتينات المهمة في التنظيم يدل نوتش (خدران ، الشريك في GFP - خدران أو Sanpodo يمكن - GFP) العائد معلومات هامة في آليات انقسام الخلايا والأغشية الاتجار غير المتماثلة البروتين 2،3،7،10،11.
الشكل 1 : تشريح العذراء والتركيب. أ. الخطوة بخطوة تظهر الصور الإجراء لإزالة حالة العذراء وإعداد الشرانق سليمة لتصوير الخلايا الحية والتركيب. شرانق يتم إزالتها من قارورة وضعت ، حتى الجانب الظهري ، على الشريط المزدوج عصا موصولة إلى شريحة زجاجية. العمود الأول ، وإزالة وتمزيق الوصاد على طول الجانب من القضية العذراء. العمود الثاني ، وإزالة حالة العذراء من منطقة الصدر والبطن. ثم يتم رفع خادرة خالية من حالة العذراء به شعيرات فرشاة ناعمة. B. تركيب الشرانق بين الشرائح وساترة. يوضع خادرة الجانب الظهري حتى على شريحة زجاجية ، محاط بإطار من الورق المبلل Whatman. حبة المستمر للسيليكون الشحوم فراغ مقذوف من الوظائف حقنة 5cc لختم تركيبة الانزلاق ساترة ، وحماية خادرة من أصاب ورفع ساترة لذلك تقع على الصدر بلطف العذراء. قطرة ماء صغيرة (1 ميكرولتر) في واجهة بين ساترة وبشرة الصدر يحسن من جودة الصورة بشكل ملحوظ عند استخدام الأهداف الغمر (الماء أو الزيت). اضغط هنا لعرض صورة أكبر حجما.
الشكل 2 : صور الممثل من الخلايا الحية ومتباينة SOP الحواس الخارجية التي يتم التقاطها باستخدام تشريح لدينا العذراء وتصاعد الداخلي. A. الصور المستخرجة من سلسلة زمنية من الإنقسامية معربا عن الخلية SOP - أكتين البروتين GFP الانصهار تحت سيطرة neuralized - Gal4 ( neur - Gal4/UAS-actin-GFP) ، لاحظ تراكم القشرية من أكتين في ثلم الانقسام (1 صورة / كل دقيقة 2). B. الخلايا الوليدة SOP المشترك معربا عن شريك RFP - خدران (الحمراء) ، وRab5 - GFP مدفوعا neuralized - Gal4 ، لاحظ التوزيع غير المتساوي لبون ، RFP في خلية ابنة واحدة (pIIb) وتوزيعها في وقت مبكر من الإندوسومات في كل من الخلايا الوليدة. C. مما يجعل من حجم Z - اتخذت سلسلة من الأجهزة المختلفة الحسية الخارجية في مرحلة العذراء في وقت متأخر. هياكل بشرة ، مثل mechnosensory شعيرات وكشف الشعر البشرة بواسطة تألق ذاتي إهاب (الحمراء). بالإضافة إلى ذلك ، لقد استخدمنا نظام MARCM للتعبير عن LGL - GFP (مدفوعة neuralized - Gal4) في مجموعة فرعية من الخلايا الحسية السلائف الجهاز (الخضراء). (تم الحصول عليها عن هذه الصور باستخدام مجهر المسح C1 نيكون مبائر باستخدام 60X الهدف NA 1.45)
المناقشة
في هذا الفيديو ، ونحن لتوضيح تقنية لعزل وتصاعد ذبابة الفاكهة pupaefor يعيش التصوير خلية من خلايا SOP على notum العذراء. إزالة الشرانق من القضية العذراء يتطلب مطرد من ناحية ، والأدوات المناسبة ، وممارسة بعض ، ولكن من السهل على التعلم. فمن المهم أن يتم التدريج من الشرانق بدقة ، من أجل ضمان السهولة النسبية للتشريح واصطياد مرحلة الانتشار التنمية سوب. شنت مرة واحدة ، وسوف تواصل تطوير الشرانق بين الشرائح وساترة ، وفي معظم الحالات ، سوف يصل الى مرحلة الكبار pharate وeclose في نهاية المطاف. في تجربتنا ، ويمكن تصوير الخلايا على مدى عدة ساعات. لا يقتصر هذا الأسلوب متزايدة لمراقبة السلائف خلايا الجهاز العصبي المحيطي على الصدر العذراء ، ولكن يمكن استخدامها لتصور أي الخلايا التي هي قريبة من سطح بشرة ويمكن الوصول إلى الهدف المجهر ، (يرجى ملاحظة أن تتم في مرحلة الملاحظات عندما يمكن أن تكون قضية إزالة العذراء دون قتل خادرة ، عادة حوالي 10 إلى 14h بعد تشكيل puparium). لدينا تصور وصلي بنجاح البروتينات ، والبروتينات هيكل الخلية والمنظمين الاتجار حويصلة في الخلايا الظهارية العذراء (بيانات غير منشورة).
وقد سمحت تقنية العذراء تصاعد لنا أيضا لتطوير طريقة لهياكل صورة جليدية في مرحلة متأخرة الشرانق باستخدام مجهر المسح مبائر ، من أجل تصور مورفولوجية mechanosensory شعيرات البشرة والشعر باستخدام تألق ذاتي جوهري للبشرة. هذه الصور تشبه المسح micrographs الإلكترون من إهاب الطيران ، ولكن يمكن الحصول عليها من الحيوانات الحية ، وتسمح لنا في الوقت نفسه تصور جليدية التشكل والتعبير عن مضان GFP 6،7،12.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر J. Knoblich (IMP ، فيينا) ، والسيد غونزاليس غايتان (جامعة جنيف) عن ذبابة الفاكهة الأسهم وشينيا اينو والمسيحية Sardet الذي البحرية الجنين تقنيات التركيب وكانت مصدر إلهام لتطوير هذه التقنية. وقد تم تطوير هذا البروتوكول في البداية في مختبر YN جان. معتمدة من قبل الاب وDZ NS059971 NIH RO1 منحة ، والتسوية التبغ صندوق ولاية بنسلفانيا ، ومركز فوكس تشيز للسرطان.
المواد
- سكوتش الشريط المزدوج عصا
- الشريحة الزجاجية
- 18mmX18mm ساترة
- ملقط
- Whatman الورق
- داو كورننغ فراغ سيليكون الشحوم
- 5 مل حقنة
- Pipetter
- مبائر أو epifluorescence المجهر
المراجع
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Two types of asymmetric divisions in the Drosophila sensory organ precursor cell lineage. Nat Cell Biol. 3, 58-67 (2001).
- Bellaiche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nat Cell Biol. 3, 50-57 (2001).
- Emery, G., Knoblich, J. A. Endosome dynamics during development. Curr Opin Cell Biol. 18, 407-415 (2006).
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Bazooka is required for localization of determinants and controlling proliferation in the sensory organ precursor cell lineage in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 14469-14474 (2001).
- Roegiers, F. Frequent unanticipated alleles of lethal giant larvae in Drosophila second chromosome stocks. Genetics. 182, 407-410 (2009).
- Tong, X. Numb independently antagonizes Sanpodo membrane targeting and Notch signaling in Drosophila sensory organ precursor cells. Mol Biol Cell. 21, 802-810 (2010).
- Jafar-Nejad, H. Sec15, a Component of the Exocyst, Promotes Notch Signaling during the Asymmetric Division of Drosophila Sensory Organ Precursors. Dev Cell. 9, 351-363 (2005).
- Karbowniczek, M. The evolutionarily conserved TSC/Rheb pathway activates Notch in tuberous sclerosis complex and Drosophila external sensory organ development. J Clin Invest. 120, 93-102 (2010).
- Coumailleau, F., Furthauer, M., Knoblich, J. A., Gonzalez-Gaitan, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458, 1051-1055 (2009).
- Emery, G. Asymmetric rab11 endosomes regulate delta recycling and specify cell fate in the Drosophila nervous system. Cell. 122, 763-773 (2005).
- Justice, N., Roegiers, F., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Lethal giant larvae acts together with numb in notch inhibition and cell fate specification in the Drosophila adult sensory organ precursor lineage. Curr Biol. 13, 778-783 (2003).
إعادة الطباعة والأذونات
