بروتوكول مينيملي لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري وأداء الماوس المتكررة في الجسم الحي تصوير الحبل الشوكي باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. هذا الأسلوب يجمع بين جهاز تثبيت العمود الفقري ونظام للحد من مخدر الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات وإنتاج بيانات التصوير الخام التي لا تحتاج إلى محاذاة أو غيرها في مرحلة ما بعد المعالجة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الجسم الحي التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري 1 في الفئران التي تمت هندستها وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية في أنواع الخلايا المحددة 2-3 اتسع بشكل ملحوظ معرفتنا العمليات الفسيولوجية والمرضية في أنسجة عديدة في الجسم الحي 4-7. في دراسات الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، كان هناك تطبيق واسع النطاق في مجال التصوير من المجراة في الدماغ ، الذي أنتج مجموعة كبيرة من النتائج غير المتوقعة والرواية كثيرا عن سلوك من الخلايا مثل الخلايا العصبية ، الخلايا النجمية ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، في إطار ظروف فيزيولوجية أو مرضية 17/08. ومع ذلك ، فقد التعقيدات التقنية محدودة معظمها في تنفيذ التصوير في الدراسات المجراة الذين يعيشون الحبل الشوكي الماوس. على وجه الخصوص ، على مقربة التشريحية من الحبل الشوكي إلى الرئتين والقلب الكبير يولد حركة القطع الأثرية التي تجعل من تصوير الحبل الشوكي المعيشة مهمة صعبة. طورنا أسلوب الرواية التي يتغلب على القيود المتأصلة في تصوير الحبل الشوكي عن طريق تثبيت العمود الفقري ، والحد من الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات وبالتالي تيسير استخدام ثنائي الفوتون المجهري لصورة الحبل الشوكي الماوس في الجسم الحي. ويتحقق ذلك من خلال الجمع بين جهاز مخصص لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري مع وسيلة لتخدير عميق ، مما أدى إلى انخفاض كبير في الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات. هذا البروتوكول فيديو يوضح كيفية كشف مساحة صغيرة من الحبل الشوكي الحية التي لا يمكن الحفاظ عليه في ظل الظروف الفسيولوجية مستقرة على مدى فترات طويلة من الزمن عن طريق الحفاظ على إصابة الأنسجة والنزيف إلى أدنى حد ممكن. الحصول على الصور الخام ممثل بالتفصيل المجراة في ارتفاع القرار على العلاقة الوثيقة بين الأوعية الدموية والخلايا الدبقية الصغيرة في. تسلسل timelapse يوضح السلوك الديناميكي للعمليات دبقية صغيرة تعيش في الحبل الشوكي الماوس. علاوة على ذلك ، تفحص المستمر من الإطار - Z إثبات نفسهق استقرار المعلقة أن هذا الأسلوب يمكن أن يحقق لتوليد اكوام من الصور و / أو الأفلام timelapse التي لا تتطلب محاذاة صورة ما بعد الاستحواذ. أخيرا ، وتبين لنا كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لإعادة النظر في وreimage نفس المنطقة من الحبل الشوكي في timepoints في وقت لاحق ، مما يسمح للدراسات طولية من العمليات الجارية فيزيولوجية أو مرضية في الجسم الحي.
البروتوكول
1. بناء جهاز تثبيت العمود الفقري
- النظام STS - A Narishige ضغط المشابك الحبل الشوكي وMA - 6N Narishige عقد رئيس المحول.
- العرف تصميم وصنع قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة لعقد جزأين Narishige في محاذاة بحيث يتم اعتماد رأس الحيوان في حين فرضت عموده الفقري والذيل. نضع في اعتبارنا أن الجهاز بأكمله وينبغي أن تندرج تحت عدسة المجهر عادة على مسرح المجهر خفضت.
2. جراحة الحيوان
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة الموضحة هنا يسمح مستقرة ومتكررة في مجال التصوير فيفو الهياكل ذات الكثافة السكانية العالية الخلوية فلوري في النخاع الشوكي للفئران تخدير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. والاستقرار الذي تحقق هو نتيجة لجهاز صنعت خصيصا لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري ونظام المخدر الذي يقلل من الجهاز التنفسي التي يسببها قطعة أثرية الحركة. جهاز تثبيت العمود الفقري يسمح فسحة للتنفس تحت جسم الفأر ، ويمكن بناؤها باستخدام المشابك الشوكي المتاحة تجاريا وقطعة الرأس تركيب (الشكل 1.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل عن طريق التصلب المتعدد في الجمعية الوطنية منح RG4595A1 / T لDD ومنح المعاهد الوطنية للصحة / NINDS NS051470 ، وNS052189 NS066361 إلى أرقام KA تكييفها والأفلام و / أو إعادة طبعها من دافالوس وآخرون ، J طرق Neurosci. 2008 مارس 30 ؛ 169 (1) :1 - 7 حقوق التأليف والنشر عام 2008 ، بإذن من السيفير.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| رودامين B ديكستران | Invitrogen | D1841 | 70 كيلو دالتون ، مخففة في ACSF (3 ٪ ث / ت) |
| الكيتامين حمض الهيدروكلوريك | Bionichepharma | NDC رقم : 67457-001-10 | عن طريق الحقن ، 50mg/ml |
| Anased | مختبرات لويد | ندى رقم : 139-236 | زيلازين عن طريق الحقن ، 20mg/ml |
| آسيبرومازين | Vedco | ندى رقم : 117-531 | عن طريق الحقن ، 10mg/ml |
| دموع اصطناعية مرهم | عنقاء الأدوية | NDC رقم : 57319-760 -- 25 | زيوت التشحيم |
| Betadine | الصياد | 19-061617 | |
| مكفرسون - يستكوت مقص | العالم الدقة الصكوك | 555500S | منحني ، كليلة معلومات سرية مقص |
| مستقيم الملقط | العالم الدقة الصكوك | 555047FT | ملقط مسنن الحافة |
| سفينة صغيرة يكوي | أدوات العلوم غرامة | 18000-00 | |
| جلفوم | فارماسيا ، فايزر | الخلاط مطحنة MM400 | |
| ضغط الحبل الشوكي المشابك | Narishige | STS - A | |
| عقد رئيس محول | Narishige | MA - 6N | |
| Gelseal | أمرشام العلوم الحيوية كورب | 80-6421-43 | |
| Lactated قارعو الأجراس | باكستر للرعاية الصحية | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit بينكيزر شركة المستحضرات الصيدلانية | NDC رقم : 12496 -- 6757-1 | البوبرينورفين ، حقن |
| Baytril | باير | ندى 140-913 | Enrofloxacin ، حقن مضادة للجراثيم 2.27 ٪ (20ml) |
| سادة التدفئة -- كبير | أدوات العلوم غرامة | 21060-10 |
المراجع
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
