بروتوكول مينيملي لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري وأداء الماوس المتكررة في الجسم الحي تصوير الحبل الشوكي باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. هذا الأسلوب يجمع بين جهاز تثبيت العمود الفقري ونظام للحد من مخدر الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات وإنتاج بيانات التصوير الخام التي لا تحتاج إلى محاذاة أو غيرها في مرحلة ما بعد المعالجة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الجسم الحي التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري 1 في الفئران التي تمت هندستها وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية في أنواع الخلايا المحددة 2-3 اتسع بشكل ملحوظ معرفتنا العمليات الفسيولوجية والمرضية في أنسجة عديدة في الجسم الحي 4-7. في دراسات الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، كان هناك تطبيق واسع النطاق في مجال التصوير من المجراة في الدماغ ، الذي أنتج مجموعة كبيرة من النتائج غير المتوقعة والرواية كثيرا عن سلوك من الخلايا مثل الخلايا العصبية ، الخلايا النجمية ، الخلايا الدبقية الصغيرة ، في إطار ظروف فيزيولوجية أو مرضية 17/08. ومع ذلك ، فقد التعقيدات التقنية محدودة معظمها في تنفيذ التصوير في الدراسات المجراة الذين يعيشون الحبل الشوكي الماوس. على وجه الخصوص ، على مقربة التشريحية من الحبل الشوكي إلى الرئتين والقلب الكبير يولد حركة القطع الأثرية التي تجعل من تصوير الحبل الشوكي المعيشة مهمة صعبة. طورنا أسلوب الرواية التي يتغلب على القيود المتأصلة في تصوير الحبل الشوكي عن طريق تثبيت العمود الفقري ، والحد من الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات وبالتالي تيسير استخدام ثنائي الفوتون المجهري لصورة الحبل الشوكي الماوس في الجسم الحي. ويتحقق ذلك من خلال الجمع بين جهاز مخصص لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري مع وسيلة لتخدير عميق ، مما أدى إلى انخفاض كبير في الجهاز التنفسي التي يسببها الحركات. هذا البروتوكول فيديو يوضح كيفية كشف مساحة صغيرة من الحبل الشوكي الحية التي لا يمكن الحفاظ عليه في ظل الظروف الفسيولوجية مستقرة على مدى فترات طويلة من الزمن عن طريق الحفاظ على إصابة الأنسجة والنزيف إلى أدنى حد ممكن. الحصول على الصور الخام ممثل بالتفصيل المجراة في ارتفاع القرار على العلاقة الوثيقة بين الأوعية الدموية والخلايا الدبقية الصغيرة في. تسلسل timelapse يوضح السلوك الديناميكي للعمليات دبقية صغيرة تعيش في الحبل الشوكي الماوس. علاوة على ذلك ، تفحص المستمر من الإطار - Z إثبات نفسهق استقرار المعلقة أن هذا الأسلوب يمكن أن يحقق لتوليد اكوام من الصور و / أو الأفلام timelapse التي لا تتطلب محاذاة صورة ما بعد الاستحواذ. أخيرا ، وتبين لنا كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لإعادة النظر في وreimage نفس المنطقة من الحبل الشوكي في timepoints في وقت لاحق ، مما يسمح للدراسات طولية من العمليات الجارية فيزيولوجية أو مرضية في الجسم الحي.
البروتوكول
1. بناء جهاز تثبيت العمود الفقري
- النظام STS - A Narishige ضغط المشابك الحبل الشوكي وMA - 6N Narishige عقد رئيس المحول.
- العرف تصميم وصنع قاعدة الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة لعقد جزأين Narishige في محاذاة بحيث يتم اعتماد رأس الحيوان في حين فرضت عموده الفقري والذيل. نضع في اعتبارنا أن الجهاز بأكمله وينبغي أن تندرج تحت عدسة المجهر عادة على مسرح المجهر خفضت.
2. جراحة الحيوان
- قبل حرارة الغرفة المجهر مع الهواء جهاز التدفئة والحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية.
- وزن الحيوان وجعل هذا المزيج باستخدام مخدر الكيتامين 100 ملغ ، 15 ملغ و 2.5 زيلازين آسيبرومازين ملغ لكل كيلوغرام من وزن الجسم ، ويخفف في محلول كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ في ظل ظروف معقمة.
- تخدير عن طريق حقن الحيوان المزيج مخدر (KXA) intraperitoneally. يجب أن يتم تنفيذ العادية معسر أخمص القدمين لضمان تخدير عميق في جميع أنحاءالتجربة. الملحق مع جرعة نصف ساعة الأصلي أو حسب الحاجة.
- استخدام وسادة التدفئة الحيوانات الصغيرة لتقديم الدعم الحرارية أثناء تنفيذ العملية الجراحية.
- تطبيق مرهم الدموع الاصطناعية في العيون لمنع جفاف القرنية والاضرار.
- حلق ظهر أول حيوان مع جهاز تقليم ثم بشفرة حادة لإزالة الشعر من المنطقة حول شق.
- إزالة الشعر وحلق تطهير سطح الجلد حلق مع منصة الكحول.
- تنفيذ صغيرة (~ 1.5 سم) شق طولي من الجلد على مستوى العمود الفقري المطلوب (الفقرات الصدرية هو موضح هنا).
- يعرض عضلات الظهر من خلال التراجع بعناية النسيج الضام تحت الجلد.
- منفصلة بعناية عضلات مجاورة للفقرة من العمود الفقري على المستوى المطلوب. أداء أقل عدد ممكن شقوق لفصل العضلات من كلا الجانبين من كل عملية الشائكة ومن ثم كشط عضلات بمعزل عن العالمالطريق من سطح الصفحي.
- اختيار الصفيحة التي سيتم إزالتها وتحضير مواقع لدخول المشابك الشوكي على كل جانب من العمود الفقري ، والذيلية منقاري فورا إلى الثقب. تهجير بعناية النسيج العضلي لإعداد أربع جيوب حيث سيتم إدراج المشابك.
- رفع العمود الفقري مع ملقط مسنن اخبارية مباشرة للسماح الإدراج الآمن للفظة مقص معلومات سرية تحت الصفيحة المنحنية دون لمس الحبل الشوكي. نفذ الثقب عن طريق قطع العظام ببطء على جانب واحد ، ثم على الجانب الآخر.
- استخدام مسحة القطن أو إدراج قبل القطع الصغيرة جلفوم امتصاص قطعة الاسفنج الجيلاتين بجوار الشقوق للحد من نزيف طفيفة. استخدام cauterizer سفينة صغيرة للسيطرة على النزيف مرة أخرى إذا لزم الأمر. استخدام مسخن عقيم السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) لغسل الأنسجة.
3. تحقيق الاستقرار في العمود الفقري ، والإعداد للتصوير في الجسم الحي
- PLAC ه الحيوان على منصة الارتفاع على لوحة قاعدة الجهاز لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري والرأس في تأمين محول رئيس القابضة.
- وضع المشابك الشوكي للجهاز A - STS على طول المحور الأمامي الخلفي للحيوان في جيوب معدة سلفا المحيطين الثقب (الشكل 1). ينبغي وضع المشابك اثنين في زاوية من ~ 45 درجة بالنسبة للمحور rostro - الذيلية الحيوان للسماح مساحة كافية لخفض عدسة غمر الماء على الحبل الشوكي معرضة (الشكل 1).
- ضع المشبك الثالث للجهاز A - STS على قاعدة الذيل بحيث يمكن تعليق جسم الحيوان في الهواء بعد إزالة لوحة الارتفاع لمدة من تجارب التصوير (الشكل 1).
- بناء بئر صغيرة من Gelseal (أمرشام العلوم البيولوجية كورب) حول الحبل الشوكي معرضة لتسهيل الحفاظ على النخاع الشوكي في ACSF وغمر عدسة المجهر في هذا الحل لالمجراة في التصوير.
- نقل الحيوانات على الجهاز الاستقرار في العمود الفقري داخل غرفة محمى تغطي المجهر وثبته على مسرح المجهر خفضت وضع الثقب مباشرة تحت العدسة (الشكل 1).
- انخفاض عدسة غمر المياه بعناية في حل ACSF التأكد من أنها لا تلمس المشابك الشوكي أو في Gelseal.
- استخدام epifluorescence لتحديد مجال الاهتمام والتركيز على ذلك. التبديل إلى وضع وتنفيذ مسح بالليزر في مجال التصوير فيفو باستخدام الليزر المناسب إثارة اثنين فوتون الطول الموجي ، وممر الموجة dichroics المرشحات للfluorophores موجودة في الأنسجة المصورة.
5. تكرار التصوير والرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية
- في نهاية التجارب والتصوير ، وإزالة الماوس من الجهاز لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري ويمسح بعناية Gelseal من المنطقة حول الثقب.تنظيف المنطقة جيدا.
- استعادة وخياطة عضلات الظهر خلال الثقب.
- استعادة وخياطة الجلد فوق الثقب ، مع مسحة betadine.
- 1 توفير حل مل قارعو الأجراس Lactated (باكستر للرعاية الصحية) كمكمل المغذيات والماء ، فضلا عن العلاج مسكن تحت الجلد (0.1 ملغ / كلغ البوبرينورفين).
- إدارة مطهر intraperitoneally العلاج (0.03 مل في الماوس ، enrofloxacin حقن محلول مضاد للبكتيريا 2.27 ٪).
- الحيوان مكان على لوحة التسخين حتى الشفاء التام من التخدير وبيت لاحقا بشكل فردي.
- كرر الادارة مطهر يوميا لمدة 3-5 أيام الأولى بعد الجراحة والعلاج مسكن كل 8-12 ساعة لمدة 2-3 أيام بعد العملية. مراقبة الحيوانات يوميا لضمان السلوك الطبيعي والشفاء التام.
- لإعادة التصوير من خلال الثقب نفسه ، فتح خياطة الجلد والعضلات وكرر الخطوات المذكورة في القسمين 2 -- 4.
- إعادة تحديد موقع previتصوير ously المنطقة باستخدام الأوعية الدموية الدم كخريطة كما هو موضح سابقا 10.
6. ممثل النتائج
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية في إطار المبادئ التوجيهية التي وضعتها رعاية الحيوان واللجان المؤسسية استخدم في جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، ويتم وفقا للوائح الفيدرالية. ويظهر صورة لجهاز تثبيت العمود الفقري وتخطيطي يبين موضع ماوس على الجهاز تحت عدسة المجهر في الشكل 1. إتاحة المجال الكافي للحركات التنفس تحت جسم الحيوان يضمن استقرارا في التصوير المجراة في الحبل الشوكي. الشكل 2 يوضح العلاقة الوثيقة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والأوعية الدموية وكما كان تصويره في الجسم الحي في الحبل الشوكي من Cx3cr1 GFP / + الفئران المعدلة وراثيا 18 ، التي وصفت التطور الطبيعي مع الخلايا الدبقية الصغيرة GFP. ويبين الشكل 3 أمثلة متكررةفي مجال التصوير فيفو كما تم تنفيذ ذلك في مجالات الحبل الشوكي نفسه في الفئران التعبير عن بروتين فلوري في المحاور العصبية في العمود الفقري (YFP - H الخط 3) والخلايا الدبقية الصغيرة (في الفئران Cx3cr1 GFP + /).
الشكل 1. تثبيت العمود الفقري للماوس في الجسم الحي التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري : (أ) استخدمت قاعدة فولاذية صنعت خصيصا لوحة لدعم ومواءمة STS - A المدمجة المشابك Narishige الحبل الشوكي وMA - 6N Narishige عقد رئيس محول كما هو موضح هنا. (B) لتحديد المواقع المناسبة من الفئران المعدلة وراثيا الكبار مع تخدير مخدر KXA على الجهاز الاستقرار في العمود الفقري. إدراج يبين موضع المشابك الشوكي فورا وrostrally caudally إلى استئصال الصفيحه ويتعرض النسيج في الحبل الشوكي.
الشكل 2. التصوير في الخلايا الحية دبقية صغيرة عالية الكثافة والأوعية الدموية في الحبل الشوكي للفئران تخدير. ولكن من المتوقع عدم الانحياز Z - أكوام من (أ) عالية الكثافة GFP إيجابية الخلايا الدبقية الصغيرة (الخضراء) في الحبل الشوكي لGFP CX3CR1 الماوس + / على مقربة مع الأوعية الدموية (أحمر ، وصفت مع حقن الرابع من ديكستران رودامين). (ب) صورة عالية التكبير وصفت بأنها في (أ) من خلية واحدة دبقية صغيرة تعلق على جدار الوعاء الدموي مع العمليات الموسعة حول سفينة ونحو لحمة الحبل الشوكي. أشرطة النطاق ، 10μm.
الشكل 3. المتكرر في التصوير المجراة من شرائح محواري نفسها والخلايا الدبقية الصغيرة حيث تم نقلهم وreimaged في الحبل الشوكي للفئران تخدير في أيام مختلفة. (أ) YFP - LAB إليد المحاوير في الأيام 0 و 5. (B). التقط نفس الهياكل الأوعية الدموية وخلايا دبقية صغيرة من حولهم في الجسم الحي في الحبل الشوكي من Cx3cr1 GFP / + على الفئران أيام 0 و 1. أشرطة النطاق ، 10μm.
الفيلم الممثل timelapse 1. تسلسل المكتسبة في الجسم الحي من الحبل الشوكي الماوس. هذا التسلسل يظهر في التفاصيل الدقيقة ديناميات العملية دبقية (الخضراء) وتفاعلاتها مع الأوعية الدموية (أحمر ، وصفت مع حقن الرابع من ديكستران رودامين) بمرور الوقت داخل الأنسجة ذات الكثافة السكانية العالية مع الهياكل الفلورسنت. تم تصحيح الصور الخام فقط عن سطوع الخلفية ، الضجيج والتباين وشيد الفيلم timelapse بواسطة Z - إسقاط صورة مداخن المكتسبة بالتسلسل ، من دون محاذاة الصورة ، أو المتوسط ض اختيار طائرات الفردية. الأوعية الدموية تذهب من خلال مجموعة مماثلة من طائرات ض كما صور الخلايا الدبقية الصغيرة. Z عمق الطائرة : 38 ميكرومتر.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
تسلسل الفيلم Timelapse 2. مما يدل على استقرار الخام للأسلوب التصوير على مستوى طائرة زي واحد. اقتناء سريع من نفس واحدة ض الطائرة في النخاع الشوكي للفئران GFP CX3CR1 / + وضعت على جهاز تثبيت العمود الفقري تحت التخدير KXA ، يوضح الحد الأدنى من التشرد بين الإطارات صورة متتالية بمعدل المسح من 1 ق / الإطار الذي هو أسرع من معدل التنفس من الفأرة. نزوح ثانوية المتبقية ربما يرجع الى ضربات القلب. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة الموضحة هنا يسمح مستقرة ومتكررة في مجال التصوير فيفو الهياكل ذات الكثافة السكانية العالية الخلوية فلوري في النخاع الشوكي للفئران تخدير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. والاستقرار الذي تحقق هو نتيجة لجهاز صنعت خصيصا لتحقيق الاستقرار في العمود الفقري ونظام المخدر الذي يقلل من الجهاز التنفسي التي يسببها قطعة أثرية الحركة. جهاز تثبيت العمود الفقري يسمح فسحة للتنفس تحت جسم الفأر ، ويمكن بناؤها باستخدام المشابك الشوكي المتاحة تجاريا وقطعة الرأس تركيب (الشكل 1...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل عن طريق التصلب المتعدد في الجمعية الوطنية منح RG4595A1 / T لDD ومنح المعاهد الوطنية للصحة / NINDS NS051470 ، وNS052189 NS066361 إلى أرقام KA تكييفها والأفلام و / أو إعادة طبعها من دافالوس وآخرون ، J طرق Neurosci. 2008 مارس 30 ؛ 169 (1) :1 - 7 حقوق التأليف والنشر عام 2008 ، بإذن من السيفير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| رودامين B ديكستران | Invitrogen | D1841 | 70 كيلو دالتون ، مخففة في ACSF (3 ٪ ث / ت) |
| الكيتامين حمض الهيدروكلوريك | Bionichepharma | NDC رقم : 67457-001-10 | عن طريق الحقن ، 50mg/ml |
| Anased | مختبرات لويد | ندى رقم : 139-236 | زيلازين عن طريق الحقن ، 20mg/ml |
| آسيبرومازين | Vedco | ندى رقم : 117-531 | عن طريق الحقن ، 10mg/ml |
| دموع اصطناعية مرهم | عنقاء الأدوية | NDC رقم : 57319-760 -- 25 | زيوت التشحيم |
| Betadine | الصياد | 19-061617 | |
| مكفرسون - يستكوت مقص | العالم الدقة الصكوك | 555500S | منحني ، كليلة معلومات سرية مقص |
| مستقيم الملقط | العالم الدقة الصكوك | 555047FT | ملقط مسنن الحافة |
| سفينة صغيرة يكوي | أدوات العلوم غرامة | 18000-00 | |
| جلفوم | فارماسيا ، فايزر | الخلاط مطحنة MM400 | |
| ضغط الحبل الشوكي المشابك | Narishige | STS - A | |
| عقد رئيس محول | Narishige | MA - 6N | |
| Gelseal | أمرشام العلوم الحيوية كورب | 80-6421-43 | |
| Lactated قارعو الأجراس | باكستر للرعاية الصحية | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit بينكيزر شركة المستحضرات الصيدلانية | NDC رقم : 12496 -- 6757-1 | البوبرينورفين ، حقن |
| Baytril | باير | ندى 140-913 | Enrofloxacin ، حقن مضادة للجراثيم 2.27 ٪ (20ml) |
| سادة التدفئة -- كبير | أدوات العلوم غرامة | 21060-10 |
المراجع
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
