إعداد يعيشون معزولين خلايا مستقبلة للضوء الفقارية للتصوير الإسفار

ملخص

تم وصف طريقة لإعداد واحدة من خلايا مستقبلة للضوء الذين يعيشون نوعا من الفقاريات المختلفة للتصوير مضان. ويمكن استخدام هذه الطريقة لصورة مضان من fluorophores الذاتية ، مثل NADH أو فيتامين (أ) ، أو أن من الأصباغ الفلورية خارجيا وأضاف حساسة لكاليفورنيا ^{2 +} أو غيرها من العوامل.

الملخص

في شبكية الفقاريات ، ويتم phototransduction ، وتحويل الضوء إلى إشارات كهربائية وبها قضبان وخلايا مستقبلة للضوء مخروط ^1-4. قضيب مبصرات هي المسؤولة عن الرؤية في الضوء الخافت ، والأقماع في الضوء الساطع. Phototransduction يحدث في الجزء الخارجي للخلية مستقبلة للضوء ، حجرة المتخصصة التي تحتوي على نسبة عالية من الأصباغ البصرية ، وكاشف الضوء الأساسي. تتكون صبغة بصرية من حامل اللون ، 11 -- رابطة الدول المستقلة في شبكية العين ، تعلق على البروتين ، opsin. الفوتون تمتصه صبغة بصرية isomerizes حامل اللون في الفترة من 11 -- رابطة الدول المستقلة إلى العابرة للجميع. الايزوميرة الضوئية يجلب هذا التغيير متعلق بتكوين في الصباغ البصرية الذي يبدأ سلسلة من ردود الفعل وبلغت ذروتها في تغيير محتمل في الغشاء ، وإحداث تنبيغ من التحفيز الضوء إلى إشارات كهربائية. استعادة الخلية من التحفيز تنطوي على ضوء التعطيل من وسيطة تفعيلها من خلال الضوء ، وإمكانات إعادة الغشاء. كاليفورنيا ^{2 +} ينظم نشاط العديد من الأنزيمات المشاركة في phototransduction ، ويتم تقليل تركيزه على تحفيز الضوء. في هذه الطريقة ، كا ^{2 +} يلعب دورا مهما في استعادة الخلية من التحفيز الخفيفة والتكيف للضوء الخلفية.

آخر جزء أساسي من عملية الانتعاش هو تجديد الصباغ البصرية التي تم تدميرها خلال الكشف عن الضوء من قبل الايزوميرة الضوئية من 11 في -- حامل اللون رابطة الدول المستقلة على جميع العابر ^5-7. هذا التجدد تبدأ الافراج عن ريتينال مفروق من الصباغ photoactivated ، مخلفين وراءهم opsin الاشتقاق البروتين. يتم تقليل بسرعة الإفراج عن جميع العابر الشبكية في رد فعل على جميع الاستفادة من NADPH العابر الريتينول ، ويجمع بين opsin الطازجة مع 11 -- رابطة الدول المستقلة الشبكية جلبت الى الجزء الخارجي لإصلاح صبغة بصرية. ثم يتم نقل جميع العابر الريتينول من الجزء الخارجي والى الخلايا المجاورة من البروتين الناقل المتخصصة ريتينويد Interphotoreceptor تجليد (IRBP).

ويمكن استخدام التصوير مضان من خلايا مستقبلة للضوء واحد لدراسة علم وظائف الأعضاء وبيولوجيا الخلية. كاليفورنيا ^{2 +} يمكن حساسة الأصباغ الفلورية يمكن استخدامها لفحص بالتفصيل التفاعل بين الجزء الخارجي كا ^{2 +} التغيرات والاستجابة للضوء ^12/08 فضلا عن دور الكالسيوم الجزء الداخلي ^{2 +} مخازن في كا ^{2 +} التوازن ^13،14 . ويمكن أيضا أن تستخدم الأصباغ الفلورية لقياس تركيز المغنيسيوم ^{2 + 15} ، ودرجة الحموضة ، وكأثر من الغشاء المائي والمقصورات ^16. أخيرا ، يمكن استخدام مضان الجوهرية للجميع عبر الريتينول (فيتامين أ) لرصد حركية من تشكيلها ، وإزالة خلايا مستقبلة للضوء في واحدة ^17-19.

البروتوكول

1. إعداد أطباق Sylgard المغطاة وغرف التجريبية ، وشفرات الحلاقة

1. وهناك حاجة إلى 35 مم فالكون أطباق بتري المغلفة مع الاستومر Sylgard لتقطيع السليم للشبكية معزولة للحصول على خلايا مستقبلة للضوء واحدة. مستعدة الاستومر وفقا لتعليمات المورد وسكب كمية صغيرة في كل صحن لتغطية الجزء السفلي مع طبقة. استبدال الطبق بعد يغطي الطلاء وتخزينها. في غضون الأيام القليلة المقبلة لالاستومر يصلب وأطباق جاهزة.
2. مبصرات معزولة ضرورة التمسك الجزء السفلي من الغرفة التجريبية بحيث انهم ثبتوا خلال تجربة التصوير. ويتحقق ذل....

المناقشة

إذا لم يتم الحصول على الخلايا المعزولة صحية ، والمشكلة تكمن إما العزلة أو صحة شبكية العين أو مع تقطيع والخمسين. عادة ، بعد إزالة الجزء الأمامي من العين والجسم الزجاجي ، والشبكية ترفع بسهولة قبالة ظهارة الصباغ. إذا لم يكن ، في محاولة لقشر تشغيله ابتداء من محيط فنجان العين. إذا كان لا يزال من الصعب الفصل ، وهو احتمال من المرجح أن هذا الحيوان لم تتكيف مع الظلام لفترة كافية من الوقت ، أو ضوء أحمر لامع جدا. ضمان التكيف السليم داكنة للحيوان ، وخافت الضوء الأحمر. يمكن وجود المستقبلات الض.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
اسم	شركة	فهرس العدد	تعليقات
الغرفة المظلمة (100-150 قدم 2)
أضواء حمراء 19			متاجر
مصادر الأشعة تحت الحمراء والأشعة تحت الحمراء للمشاهدين صورة	FJW البصرية سيستمز
تشريح المجهر 19			تجهيزه مع المشاهدين الأشعة تحت الحمراء
مجهر Epifluorescence المغلقة في قفص محكم ضوء 19
تشريح أدوات (مقص ، ملقط ، حامل شفرة)	Roboz أو أدوات العلوم الجميلة
Sylgard الاستومر	إيسيكس (شارلوت في نورث كارولاينا)	Sylgard عدة الاستومر 184
بولي - L - الأورنيثين (0.01 ٪)	سيغما الدريخ	P4957
بولي - L - يسين (0.1 ٪)	سيغما الدريخ	P8920	تمييع إلى 0.01 ٪
غرف التجريبية	نذير الثمينة (حمدان ، CT)	D3512P
أطباق بتري ، الماصات البلاستيكية	فيشر العلمية