$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. متساوي المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية من NOA63
- وأعدت غرفة علاج مخصص باستخدام شريحة زجاجية (75 ملم × 25 ملم × 1 مم) ، (أ) 1 هل مم تفلون سميكة ، وصفيحة الألمنيوم (75 ملم × 25 ملم × 3 مم) كما هو مبين في الشكل 1. الغرفة يعقد معا باستخدام مقاطع الموثق صغيرة.
- حقن NOA63 في الغرفة من خلال ثقب في تفلون هل باستخدام إبرة قياس 18. يمكن أن تكون ساخنة NOA63 بلطف لتخفيف الحقن.
- مكان الغرفة على طبق ساخن وضعت في 125 درجة مئوية ، وتسمح للحرارة لدرجة حرارة موحدة لمدة 5 دقائق.
- قبل علاج NOA63 في غرفة مصباح الأشعة فوق البنفسجية (λ أقصى = 365 نانومتر ، وانظر الجدول) لمدة 20 دقيقة مع الطول 6.5 مصباح من على سطح الزجاج.
- إزالة NOA63 من الغرفة الدافئة بينما باستخدام شفرة حلاقة.
- بعد علاج NOA63 تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 3 40 م ح على طبق ساخن عند 125 درجة مئوية.
- تخزين NOA63 المجفف في -20 درجة مئوية.
2. شكل توصيف ذاكرة NOA63
- إعداد العينات التي الدمبل الساخنة الضغط على الشفاء NOA63 فيلم مع لكمة مخصصة (انظر الجدول) ، وأبعادها هو مبين في الشكل 2.
- تحميل العينة في تحليل ميكانيكي الحيوي (DMA ، انظر الجدول) لاعبا اساسيا مع الشد. تعيين أداة ل"قوة مراقبة" واسطة ، ثم إجراء اختبار البرنامج على النحو التالي :
- يوازن في 95.00 درجة مئوية
- متساوي الحرارة 10،00 دقيقة
- المنحدر القوة 0،300 N / دقيقة الى 2.500 N
- متساوي ل5.00 دقيقة
- المنحدر 2.00 درجة مئوية / دقيقة إلى 20.00 درجة مئوية
- متساوي الحرارة 10،00 دقيقة
- المنحدر القوة 0،300 N / دقيقة الى 0.015 N
- متساوي ل5.00 دقيقة
- المنحدر 2.00 درجة مئوية / دقيقة إلى 95.00 درجة مئوية
- كرر الخطوات من 2-9 مرتين أكثر
3. إعداد أحدث ركائز الثقافة الخليوي
- يمكن إعداد نماذج فردية من الفيلم SMP isothermally الشفاء. قطع الفيلم SMP بشفرة الحلاقة لحجم العينة المطلوبة. ضع SMP على طبق ساخن وضعت في درجة حرارة أعلى من جي تي للحد من المعامل وسهولة القطع.
- يمكن ان تكون ثابتة على شكل مؤقت في عدد من الطرق المختلفة. هنا نستخدم الضغط الهيدروليكي مقعد العلوي مع تسخين / تبريد platens لينقش تضاريس مؤقتة. ضبط درجة حرارة platens عند درجة حرارة أعلى من T ز.
- وكان قدم من قبل المزخرف الايبوكسي علاج على سجل الفينيل. وسوف ينتج هذا شكل مؤقت من الأخاديد الموازية. هنا ، كان المزخرف القمم الثلاثية 35-40 ميكرومتر مرتفعة ، ومتباعدة 60 ميكرومتر واسعة 80 ميكرومتر إربا. يمكن جعل المزخرف من المواد الأخرى وطوبوغرافيات مختلفة ، ولكن يجب أن يكون أكثر صلابة NOA63 النقش في درجة الحرارة. وضع عينات SMP على وجهه على المزخرف ووضع العينات والمزخرف في الصحافة.
- تطبيق ~ 100 كيلو التحميل المسبق لاجراء اتصالات بين platens التدفئة والعينات وعقد لمدة 5 دقائق للسماح لل~ عينات للوصول إلى درجة حرارة موحدة.
- 1-6 تطبيق ميغاباسكال الى العينات وعقد لمدة 1 دقيقة. ونؤكد من 4،7 ميغاباسكال يؤدي إلى تكرار غير مكتملة من التضاريس المزخرف. وقد تقريب الطبوغرافيا مؤقتة المنتجة قمم 25-35 ميكرون واسعة وعالية 150 ميكرون. فإن كسر SMP إذا تم تطبيق أكبر الإجهاد. تطبيق أصغر تؤكد أن أعرض طوبوغرافيات مع سعة أصغر.
- خفض درجة حرارة أقل من ز تي. هنا نستخدم قدرة تبريد مياه platens الصحافة.
- عندما تكون درجة الحرارة أقل من جي تي ، وإزالة القوة المطبقة.
- ويمكن تخزين العينات المجفف في -20 درجة مئوية. عند تخزينها في ظل هذه الظروف ، لاحظنا انخفاضا أقل من 1 ميكرون في السعة الانتعاش بعد شهرين لعينات تنقش مع الفينيل المزخرف قياسية.
4. خلية نشطة تجربة الثقافة
- يستخدم الأشعة ما فوق البنفسجية من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) لتعقيم العينات. ترتيب العينات وجهه لأسفل في أطباق عقيمة دون أغطية وبدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لش ح 6
- عينات الوجه لأطباق جديدة مواجهة عقيمة. بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لش ح 6
- عينات الآن بحاجة إلى أن معايرتها إلى حالة مستقرة نسبيا قبل الطلاء مع الخلايا. وضع العينات في 96 لوحة جيدا وإضافة 150 ميكرولتر من متوسطة النمو الكامل.
- وضع لوحة في الحاضنة 30 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 حتى الوصول الى الانتعاش المطلوب جزئية. هنا نستخدم 30 ساعة لإنتاج العينات مع سعة كبيرة بما يكفي لمحاذاة الخلايا.
- ويمكن الآن أن العينات مطلي مع الخلايا. وضع العينات في 96 لوحة جديدة أيضا.
- إضافة 150 ميكرولتر من حل الخلية إلى العينات. هنا نستخدم الخلايا الليفية الماوس C3H/10T1/2 الجنينية في خلايا 20000 / مل لتحقيق الخلايا المعزولة (عموما ليست على اتصال مع الخلايا الأخرى).
- للسماح للخلايا لإرفاق وانتشارها على تضاريس مؤقتة ، تتم في الحاضنة 30 درجة مئوية مقابل 9.5 ساعة.
- لmorphol الخلية مقايسةogy قبل الانتقال ، وإزالة عينات وإجراء التلوين والتصوير مضان من العينات. يسلك هذه المواد تألق ذاتي من خلال أكثر من نطاق الأشعة فوق البنفسجية والمرئية. ينصح Fluorophores في النهاية الحمراء من الطيف بعيدة مثل اليكسا فلور 647 للحد من الخلفية.
- لتشغيل عينات لاسترداد ، نقل لوحة لحاضنة 37 درجة مئوية وتستمر لمدة 19 ساعة الثقافة للسماح لاسترداد المواد والسماح للخلايا للتكيف مع التشكل على تضاريس جديدة.
- إزالة البقع وتطبيق العينات المناسبة (phalloidin للتصوير أكتين الخيطية) والتصوير الإجراءات.
5. ممثل النتائج :
شفي NOA63 هو شفافة ، صلبة زجاجي يحتوي على ذاكرة ممتازة خصائص الشكل كما هو مبين في الشكل 3. في هذه الحالة المادية شفي كما في البروتوكول 1 أعلاه ، ويبين زي تي غرام من 51.1 درجة مئوية (تحديد من بداية انخفاض E '). لوحظ واحدة من دورات الطريقة ذاكرة الشكل (التدفئة ، والتشويه ، والتبريد ، شفاء ، والشكل 3) أنه تم إصلاح نسبة كبيرة من سلالة بعد تفريغ عند 20 درجة مئوية ، والمقابلة لتحديد نسبة 15 (R) و من 89.3 ٪ (في المتوسط على مدى ثلاث دورات ، وأدناه لنفسه ص ص). استعادت سلالة ثابتة على نسبة الاسترداد (R ص) من 84.4 ٪ في مجموعة صغيرة في درجة الحرارة نسبيا أثناء التسخين. وعلاوة على ذلك ، أظهرت أداء الذاكرة شكل تدهور لا تصل إلى ثلاث دورات ، في أن كل المنحنيات اتبع بالضبط تقريبا مع بعضها البعض.
وقد استخدم NOA63 في هذا البروتوكول لأنها متاحة بسهولة من الشركة المصنعة والموردة باعتبارها prepolymer الخالية من المذيبات علاجه بسهولة مع photoinitiator. ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن تكوينها من قبل المورد. تم العثور على السماح عالية مرفق الخلية وقدرتها على البقاء. أخيرا ، يمكن ضبطها على درجة الحرارة التي تمر بمرحلة انتقالية للسماح للانتعاش حجم مجدية بين درجات الحرارة خلية two متوافق. ويمكن أيضا عدد من الأنظمة الأخرى البوليمر يمكن استخدامه مع هذا البروتوكول إذا كانت درجة الحرارة التي تمر بمرحلة انتقالية متوافق مع خلية ثقافة وإذا أنها تعزز التصاق الخلايا وقدرتها على البقاء.
اتساع تضاريس مؤقتة (أخاديد) بمرور الوقت حتى 30 درجة مئوية. قبل 30 ساعة عند 30 درجة مئوية ، فقد تم تخفيض السعة بنسبة 16 50 ٪ (الشكل رقم 4 ، والوقت 0) ~. أنه يقلل بنسبة 10 ٪ أخرى على مدى ساعة القادمة 9.5 عندما يتم تشغيل الانتعاش عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، ويقلل من السعة إلى 0.5 ٪ من السعة الأولية في غضون 9.5 ساعة. لاستخدام المزخرف والإجهاد النقش 4.9 ميغاباسكال ، وهذا يتوافق مع تغيير وظيفي من 13 ميكرومتر الأخاديد على سطح مسطح تقريبا.
مثال على سلوك الخلية للرقابة من خلال استخدام الخلايا النشطة ركائز الثقافة هو تغيير في تنظيم الهيكل الخلوي. على ركائز مخدد مؤقت قبل أن يتم تشغيل الاسترداد ، محاذاة microfilaments أكتين على طول اتجاه الأخاديد (الشكل 5A) 16. بعد الانتعاش من خلال زيادة درجة الحرارة ، وتنظيم microfilaments وموجهة بشكل عشوائي. عينات المكافحة التي الأخاديد ثابت أو على سطح مستو ثابت لا تنظيم بعد الزيادة في درجات الحرارة (الشكل 5B ، ج).

الشكل 1 : رسم تخطيطي للغرفة علاج NOA63. عرض المقطع العرضي (يسار) وعرض من أعلى إلى أسفل من دون غطاء من الزجاج (يمين).

الرقم 2 : هندسة الدمبل استخدامها لتوصيف شكل الجزء الأكبر الذاكرة W : عرض المقطع الضيقة ، L : طول الجزء الضيق ، G : طول غيج ، WO : العرض الكلي ، LO : الطول الكلي ، D : المسافة بين السيطرة ، R : نصف قطرها فيليه ، وريال عماني : دائرة نصف قطرها الخارجي

وكرر الذاكرة شكل الجزء الأكبر في اتجاه واحد لعلاج NOA63 واحد ، و 3 مرات (العلامة النجمية يشير ظهور التجريبية) : الشكل 3. في نقطة الرمز مع علامة النجمة ، وقد تم تسخين البوليمر ومشوهة ثم عن طريق تطبيق الضغط لتحديد شكله المؤقت. ويقام هذا الضغط المستمر ، وانخفضت درجة الحرارة إلى إصلاح شكل مؤقت دون ز T من البوليمر. ثم يتم زيادة درجة الحرارة ، والمواد يتعافى لشكله دائمة كما هو انخفاض الضغط مؤقتة.

الشكل 4 : يمكن أن تسبب SMP الانتعاش تحت خلية ثقافة المتوافقة مع درجات الحرارة. سعة 25.6 ± 0.8 ميكرومتر الحاضر التالية تفصيل النقشovered إلى 12.6 ± 1.5 ميكرومتر موازنة بعد ساعة و 30 حتى 30 درجة مئوية (0 مرة ، والدوائر السوداء). بعد أن تم نقل عينات الى حاضنة 37 درجة مئوية (9.5 ساعة) ، استعاد السعة إلى 1.1 ± 0.2 ميكرومتر في غضون 3.5 ساعة. استعاد السعة إلى ~ 0.3 لوحظ ± 0.1 ميكرومتر داخل 9،5 ساعة واكتشاف أي انخفاض على مدى ح 9،5 النهائي (المثلثات الحمراء). أشرطة الخطأ تمثل واحدة في قيمة الانحراف المعياري (ن = 4-6). آثار والاتصال profilometry بفحص عينات تمثيلية.

الشكل 5 : الخلية الهيكل الخلوي الأكتين يعيد ترتيب التالي الانتقال الطبوغرافية من الصور ، متحد البؤر الخلايا ملطخة phalloidin تنقش على ركائز تظهر microfilaments يتماشى مع الاتجاه الأخدود (أبيض السهم) قبل الانتقال وارتفاع درجة الحرارة. بعد الانتقال ، وترتيبها microfilaments موجهة بشكل عشوائي. ب ، خلايا السيطرة على ركائز ثابتة تظهر microfilaments موجهة بشكل عشوائي قبل وبعد ارتفاع درجة الحرارة. (ج) ، خلايا السيطرة على ركائز مخدد تظهر microfilaments يتماشى مع الاتجاه الأخدود قبل وبعد ارتفاع درجة الحرارة. شريط الحجم هو 100 ميكرون. كما اثار في الشكل 4.