نقدم تقنية للتلاعب الجيني lentiviral والتصور وحيدة الخلية العصبية الحسية الشمية محوار في محطة وتشجر في الجسم الحي.
مقالة منهجية
الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي
يفتح في علامة تبويب جديدة
في هذه المقالة
ملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تطوير دارة الشمية دقيق يعتمد على التوقع الدقيق لمحاور عصبية حسية شمية (OSN) عصبون إلى أهدافهم متشابك في البصلة الشمية (OB). ليست هي الآليات الجزيئية للنمو واستهداف محوار OSN مفهومة جيدا. التلاعب في الجينات وتصور لاحقة من المحاور OSN واحد والتشكل على جذع محطة حتى الآن كان تحديا. لدراسة وظائف الجينات على مستوى خلية واحدة ضمن إطار زمني محدد ، قمنا بتطوير تقنية lentiviral قائم على التلاعب في الجينات OSNs في الجسم الحي. يتم تسليم الجزيئات Lentiviral لOSNs بواسطة microinjection في الظهارة الشمية (OE). ثم يتم التعبير أشرطة متكاملة بشكل دائم في جينوم OSNs transduced. الأخضر التعبير بروتين فلوري يحدد الخطوط العريضة OSNs المصابين ومورفولوجيا بكاملها ، بما في ذلك محطة جذع محور عصبي. بسبب الفترة الزمنية القصيرة بين microinjection وكشف المراسل ، يمكن أن تركز دراسات وظائف الجينات خلال فترة ضيقة جدا من التنمية. مع هذا الأسلوب ، فقد اكتشفنا التعبير GFP ضمن عدد قليل من ثلاثة أيام ، وما دامت ثلاثة أشهر بعد الحقن. لقد حققنا كل من الإفراط في التعبير وshRNA بوساطة المغلوب بنسبة microinjection lentiviral. هذا الأسلوب يوفر morphologies مفصلة الهيئات الخلية OSN والمحاور على مستوى خلية واحدة في الجسم الحي ، ويسمح بالتالي توصيف وظيفة الجين مرشح خلال تنمية حاسة الشم.
البروتوكول
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. إعداد
هذا الإجراء هو السلامة الأحيائية المستوى 2 ، وبالتالي يتم إجراء جميع الاستعدادات التالية في غطاء بيولوجية حيث يتم تنفيذ الإجراء microinjection.
- إعداد وتسخين) أ (37 درجة مئوية اتربيد : تعبئة كيس من البلاستيك مع تخزين المياه -- الختم وتعيين على حاضنة التدفئة كتلة تفرغ. هذا سيسمح لاسترداد حقن الفئران التالية.
- ملء حاوية نفايات بيولوجية مع التبييض 10 ٪ على حجم مناسب لغمر جميع النفايات الناتجة عن هذا الإجراء.
- إعداد طبق صغير مفتوح من الايثانول 70 ٪ والثاني مع طبق ddH2O تعقيمها ومكان في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- تعقيم المحاقن a 5μL هاميلتون القدرات مع إبرة عيار 33 عن طريق الرش أسفل الجسم والإبرة مع 70 ٪ من الإيثانول مع المكبس انسحب كل وسيلة. نضح مرارا الايثانول من الطبق وطرد من كل وسيلة ما لا يقل عن 5 مرات.
- شطف خرطوشة المحاقن المعقمة للمياه من قبل الشفط وطرد ما لا يقل عن 5 مرات. مكان الحقنة جانبا بأمان في غطاء المحرك والثقافة ، واتركه حتى يجف.
- إزالة المخزونات الفيروسية من -80 درجة مئوية والتخزين المجمد مكان على الجليد للسماح للذوبان. Microinjection يتطلب 2μL المخزون الفيروس في الماوس في وحدات عيار 9 10 المعدية / مليلتر. ويمكن الحصول على Lentiviruses من مصادر تجارية أو المنتجة في المختبر وفقا لبروتوكول محدد (لويس وآخرون ، 2002).
- تعد مرحلة الحقن التي توفر مساحة أثيرت فوق سطح القلنسوة -- يمكن استخدام طبق الثقافة 10cm مغطاة بغطاء من Kimwipe.
- ترتيب مناديل الكحول بالقرب من محطة ضخ.
2. Microinjection الجسيمات lentiviral في الظهارة الشمية
تتم جميع الإجراءات الحيوانات التي أجريت في هذه الطريقة وفقا لمبادئ توجيهية IACUC المعتمدة. وسلالة العضلة المصحف C57BL/6J هو النموذج الحيواني المستخدمة في جميع التجارب أثبتت هنا.
- تخدير الجراء الماوس بواسطة حرارة الجسم عن طريق اتخاذ ماوس الجرو (P0 - P3) للخروج من قفص ووضع القفازات الجرو على خفض مفتوحة على الجليد لمدة 5 دقائق.
- في انتظار أن الجرو تخدير كامل ، 2μL نضح من الأسهم الفيروسية في المحاقن المعقمة هاملتون.
- ضع الماوس على رأس الجرو المرحلة الحقن. برفق الجلد بعيدا عن الجزء العلوي من الرأس على الأذن نحو الجزء العلوي من الرقبة. هذا يجب أن توفر أكثر من سطح الجلد تدرس تجويف الأنف وسيخفف الحقن.
- ادخال ابرة من خلال الجزء العلوي من تجويف الأنف عن 3mm تحت سطح الجلد لتصل إلى الظهارة الشمية. Microinject 0.5μL حل الفيروس في النار ، واختيار موقعين لكل جانب ، كل من اليسار واليمين (أربع حقن في الماوس = مجموع 2μL فيروس الحاجة). وينبغي حقن مواقع متداخلة وبصرف النظر عن بعضها البعض. لاستهداف مواقع الحقن ، البحث في السطح الظهري للجمجمة الخطوط العريضة للالبصلة الشمية. هذا الخط هو بالكاد مرئية عند الولادة عن طريق الجلد شبه شفافة والجمجمة. لجعل حقنتين لكل جانب ، وتهدف حقنة واحدة فقط لمنقاري مخطط لمبة واحدة في كل محور وسطي. جعل الإدراج second الوحشي على مخطط لمبة ، بعد التأكد من زاوية حقن بذلك بشكل إعلامي التي قد تصل إلى الظهارة الشمية التي تتواجد ventrally تحت المصباح. تجنب اختراق البصلة الشمية!
- وصمة عار الجافة أي حل الفيروس المتبقية أو الدم التي قد هرب من موقع الحقن أو فتحات الأنف باستخدام Kimwipe. التخلص فورا من Kimwipes في حاوية السائل التبييض المخفف بيولوجية.
- ضع الماوس على حقن الحاضنة اتربيد.
- كرر الخطوات من 1-4 لجميع الفئران ليتم حقنه ، وتذكر أنك سوف تحتاج حوالي 2μL المخزون الفيروس في الماوس.
- اسمحوا الفئران على استعادة الحاضنة اتربيد لمدة 30 دقيقة قبل أن تعود لهم قفصهما تداخل الأصلي.
- التخلص من المرحلة microinjection ، وتقضي على أي ورقة التعقيم والتنظيف منتجات إضافية في التخلص من السائل تبييض بيولوجية.
- تنظيف حقنة هاملتون التي تطلع المتكررة وطرد من الايثانول والماء ثم حدث في خطوات الإعداد. السماح للحقنة لتجف.
- لتحقيق الكفاءة القصوى تنبيغ تكرار هذا الإجراء مرة أخرى في 4 ساعات. ويمكن تصور OSNs المصابة في طول الخلية في عدد قليل من ثلاثة أيام.
3. المناعية تعويم المقاطع البصلة الشمية
- التضحية الماوس حقنه في نقطة الوقت المطلوب ونضح إصلاح الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4 ٪. تشريح خارج OB. في احتضان بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها ومن ثم السكروز 30 ٪ في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها. تضمين المتوسطة في تضمين أكتوبر على الجليد الجاف.
- ويتم الحصول على الاكليلية أقسام التوليد في 60μm في السمك باستخدام ناظم البرد. اكتساح المقاطع بصلة الى الثقافة 10cm الطبق مع 1X PBS 5mL (الرقم الهيدروجيني 7.4). ينبغي أن تظل أبواب العائمة في برنامج تلفزيوني للسماح للأكتوبر دissolve. نقل مقاطع العائمة وPBS إلى قارورة 50mL المخروطية.
- السماح لتسوية المقاطع في الجزء السفلي من القارورة. فراغ قبالة PBS دون امتصاص أي المقاطع. شطف أقسام الأنسجة مع PBS 20mL. كرر الخطوات تسوية وكنس. Resuspend الأنسجة مع PBS 10ML والمقاطع نقل العائمة إلى a قنينة مخروطية 15mL لimmunostaining. مرة واحدة وقد استقر أقسام الأنسجة ، وفراغ قبالة طاف PBS دون إزعاج الأنسجة. أقسام Resuspend مع 0.3 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني 1X ، ودرجة الحموضة 7.4 (PBS - TX) السماح لالمنظفات خرم أغشية الخلايا. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فراغ قبالة حضانة وطاف مع تكرار PBS - TX مرتين.
- احتضان أقسام الأنسجة في 10ML عرقلة الحل (5 ٪ مصل الخيل في برنامج تلفزيوني - TX) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
- شطف حل حجب مرتين على الأقل مع PBS - TX لمدة 15 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 2mL حل الضد الرئيسي في برنامج تلفزيوني - TX. انظر الكواشف والمعدات اللازمة لقسم الأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجربة.
- استبدال برنامج تلفزيوني second - TX تغسل بمحلول حجب الأضداد الابتدائي. احتضان على منصة ببطء هزاز (~ 30rpm) في 4 درجات مئوية لمدة 24-48 ساعة لضمان تغلغل شامل في أقسام عائمة 60μm.
- بعد مرور فترة الحضانة ، يمكن استرجاع الحل الضد الأولية باستخدام ماصة بعناية وتخزينها في 4 درجات مئوية لإعادة استخدام ما يصل الى اثنين مرات أكثر في غضون اسبوعين من دون أي خسارة كبيرة في كثافة تلوين.
- يغسل ثلاث مرات في أقسام PBS - TX لمدة 20 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة مع دوران طيف (~ 30rpm).
- إعداد 2mL التخفيف الضد الثانوية في برنامج تلفزيوني - TX. فراغ قبالة تغسل الماضي والثانوية إضافة إلى أبواب الحل الضد الأنسجة. التفاف خارج القنينة في تلطيخ رقائق الألومنيوم لمنع الخفيفة ، التي يمكن أن تسبب photobleaching fluorophore. قنينة ملفوفة مكان على منصة هزاز ببطء واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- تجاهل الثانوية حل الضد من قبل كنس بعيدا. يغسل مرة واحدة مع أقسام PBS - TX لمدة 20 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة. شطف مرتين إضافية مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 20 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة. تحميل المقاطع نسيج ملون على الزجاج باستخدام الشرائح Fluoromount G.
- الشاشة من خلال المقاطع الملون لالمحاوير OSN المصابة بشكل إيجابي ومصطلحات محوار مع المجهر الفلورسنت.
- لإنشاء عرض ثلاثية الأبعاد من محور عصبي OSN وصفت والشجرة المحطة ، وجعل سلسلة من المقاطع البصرية من خلال 60μm عمق النسيج شريحة المستهدفة اوبي (على طول المحور z) باستخدام المجهر مبائر.
- ويمكن في وقت لاحق هذا كومة من الصور ذات مقطع Z المتوقع أن تكون معا لاعادة بناء 360 درجة منظور الدورية للمحور عصبي واحد OSN المكتوب ، بما في ذلك التفاصيل محطة الشجرة بكاملها. يمكن التقاط أي واحد واحد وزاوية دوران تصديرها كملف صورة (أي JPG ، TIFF) لعرض شكل 2d.
4. ممثل النتائج
مع الأساليب المذكورة هنا ، يمكننا أن الخلايا العصبية الحسية الشمية تنبيغ بواسطة الفيروسة البطيئة في الجسم الحي. وبالتالي لدينا تصور بعيد OSNs المصابين GFP والمراسلين mCherry الفلورسنت ، وكذلك مع myc الموسومة انصهار بروتين عبر كيمياء سيتولوجية مناعية. هذه التقنية توفر وفرة من OSNs المصابة. لا يزال ، تنبيغ يحدث بشكل متقطع بما يكفي لتوفير OSNs المسمى بشكل فردي ، وبالتالي السماح لتحليل مورفولوجيا خلية واحدة. يتم تصوير المحاور والمحطات محوار داخل أقسام النسيج OB وسط بيئتهم الأصلية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 1). ويمكن عادة بأكملها OSN محوار محطة جذع يكون أسيرا داخل القسم 40 50μm البصرية. التكبير عالية من المصابين محطات محوار OSN يسمح تحليل مفصل للمورفولوجيا جذع محواري في طبقة الكبيبي.
الشكل 1. immunostained مسار واحد الشمية المحوار العصبية الحسية والشجرة في المحطة. أ) القسم الاكليل من البصلة الشمية من ماوس P7 تظهر طبقة العصب الشمي (y. قل) لالمرصد المغربي للسجون (الحمراء) ، وطبقة كبيبي (GL) immunostained مع كل من المرصد المغربي للسجون وVglut2 (الرمادي). وحيدة الخلايا العصبية الحسية الشمية محوار معربا عن GFP (الخضراء) داخل يسافر y. قل وتخترق بنية الكبيبي. B) ومورفولوجيا محوار شجرة داخل محطة الكبيبة أبرزت بوضوح من خلال التعبير GFP. Vglut2 شارك في تلوين باللون الرمادي تضيء مساحة إجمالية glomular ضمنه GFP إيجابية محوار يشرح abor المحطة. C) OSNs المصابة Lentiviral معربا عن GFP (الأخضر) في عمر الفاروق. يظهر cytostructure من الظهارة الشمية مع تلوين دابي (الأزرق). GFP التعبير التصور يسمح للهيئات OSN الخلية والعمليات الخلوية في عمر الفاروق. د) محوار OSN ومورفولوجية لها مع محطة Rap1GAP2 التعبير نهدم تلو shRNA. Lentiviruses كاسيت يحمل التعبير المزدوج مع shRNA Rap1GAP2 تحت المروج U6 الماوس وتحت GFPطبقت CMV المروج لعمر الفاروق. عرضت محطات المصابة محوار الشم أكثر مبسطة شجرة الطرفية عند مقارنة ذلك من السيطرة GFP فقط. = شريط 20μm.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Microinjection النتائج الفيروسة البطيئة في نقل الجينات ثوابت دائمة في الحمض النووي الجيني OSN. هذا الأسلوب يتيح لنا تأدية معالجات قصيرة الأجل أو طويلة الأجل من الجينات عبر مرشح أو overexpression shRNA بوساطة تدق إلى أسفل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا تسمية fluorescently OSNs واحد في خط الماوس المعدلة وراثيا الموجودة لمراقبة شاركت في توطين السكان مستقبلات الرائحة. مطلوب Microinjection لتنبيغ lentiviral من OSNs. حاولنا بيغ تعليق الفيروسة البطيئة في تجويف الأنف لتنبيغ OSNs دون أي نجاح. ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
هذا البروتوكول هو السلامة البيولوجية المستوى 2 المتوافقة. وقد وضعت جميع احتواء النفايات مساحة العمل المناسبة ، والحماية الشخصية ، والفيروسية التدابير تبعا لذلك. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لمبادئ توجيهية الحيوانية IACUC.
شكر وتقدير
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
وتدعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة وDC052256 DC006015 ، وجبهة الخلاص الوطني 0324769 لQG - T32 وDC008072 لدرجة البكالوريوس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
Microinjection : تم microinjected الفئران حديثي الولادة باستخدام محقنة 5μL هاميلتون (هاميلتون # 7647-01) مزودة إبرة قياس 33 (هاميلتون # 7762-06).
الكواشف كيمياء سيتولوجية مناعية : الأضداد الأساسي : GFP الأرنب الضد النسائل المتعددة (المسابر الجزيئية # A - 6455) ، الأجسام المضادة ضد متعدد النسائل الدجاج المرصد المغربي للسجون (المخصصة) (تشن وآخرون ، 2005) ، غينيا الخنازير الأجسام المضادة ضد متعدد النسائل VGlut2 (ميليبور # AB2251). الأجسام المضادة الثانوية : Cy2 - مترافق حمار المضادة للأرنب (جاكسون Immunolab # 711-225-152) ، حمار ، مترافق Cy3 - المضادة للدجاج (جاكسون Immunolab # 703-165-155) وCy5 مترافق الماعز المضادة للخنزير غينيا (جاكسون Immunolab # 106-175-008). وقد شنت المقاطع على الشرائح الزجاجية مع G Fluoromount (جنوب بيوتك # 0010-01) مع الحل 50ng/mL ونين دابي وصمة عار.
وقد اتخذت Z - كومة الصور باستخدام المجهر أوليمبوس Flouview FV1000 مبائر والصور التي تم جمعها ومعالجتها في التوقعات 3D باستخدام أوليمبوس اقتناء 2.01 - FV10 ASW مبائر وبرامج التحليل : مبائر التصوير.
المراجع
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن