في الجسم الحي Murine Liver Perfusion: طريقة لغرس كبد القوارض بمحلول عبر الوريد البابي

الملخص

المصدر: Cabral ، F. ، et al. تنقية خلايا الكبد والخلايا البطانية الجيبية من نضح كبد الفأر. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو إجراء لتروية كبد الفأر من خلال الوريد البابي باستخدام محلول الكولاجيناز قبل عزل خلايا الكبد.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. التحضير

1. إعداد الحلول والإعلام الثقافي
   1. إعداد جميع وسائط الاستزراع والمخزن المؤقت وفقا لجدول المواد.
2. تحضير الأدوات
   1. قم بإعداد حمام مائي (>10 لتر) عند 42 درجة مئوية ، ومضخة تمعجية بسرعة متغيرة ، ومشابك لحمل القوارير. تحضير مقص وملقط منحني (الشكل 1).
   2. على الحمام المائي أو بجوار الحمام المائي ، قم بإعداد صفيحة خبز (حوالي 38 × 26 سم) مع وسادة من الستايروفوم (رف مخروطي 50 مل) ، مغطاة بقطعة سفلية ماصة مقطعة إلى قطعة مقاس 20 × 20 سم (الشكل 1).
   3. ضع قطعة من الشريط اللاصق (5-8 سم) في مكان قريب. ضع خيط خياطة بوليستر مقاس 20 سم في مكان قريب مقطوع وجاهز للاستخدام. احصل على قسطرة بلاستيكية بإبرة قابلة للسحب (7 مم × 19 مم ، الشكل 1).
3. تحضير الأواني الزجاجية
   1. باستخدام المشابك، ضع قارورة سعة 1 لتر في الحمام المائي تحتوي على 200 مل من 1x PBS مع سدادة تحتوي على ماصتين سعة 1 مل تدخل في المحلول. يتم إحراز الفلين المطاطي للسماح بإعادة تدوير السوائل في دائرة مغلقة.
   2. باستخدام مشبك آخر ، ضع قارورة سعة 125 مل تحتوي على 45 مل من Buffer 2 جنبا إلى جنب مع سدادة تحتوي على ماصتين سعة 1 مل ، أحدهما موجود في السائل بالقرب من قاع القارورة والآخر يبقى فوق السائل وينفخ الأكسجين في القارورة.
      ملاحظه: سيكون لكل ماصة في السدادات محول فصل سريع متصل بالنهاية لسهولة تبديل الأنبوب. سيتدفق الأكسجين برفق إلى كلتا القواريرتين عبر الماصة الموجودة في السدادة غير المغمورة في السائل.
   3. ضع جانبا طبقين معقمين متبلورين.

< p class = "jove_title" >2. الإجراء الحيواني

1. قم بتسخين محاليل PBS و Buffer 2 إلى 42 درجة مئوية في الحمام المائي وقم بتدوير PBS لمدة 20 مل / دقيقة على الأقل في الأنبوب في دائرة مغلقة للحفاظ على دفء الخطوط السائلة. اغمر أي أنبوب زائد في الحمام المائي لتبقى قريبا قدر الإمكان من 42 درجة مئوية. قم بتصريف الطرف الذكري للأنبوب في قارورة سعة 1 لتر تحتوي على PBS.
2. ضع كرة قطنية على الوسادة السفلية الماصة وأضف حوالي 2 مل من 30٪ من الأيزوفلوران (المكون من البولي إيثيلين جلايكول 200 مما يقلل من معدل تبخر الأيزوفلوران) على كرة القطن باستخدام ماصة النقل.
3. التقط الفأر من الذيل ، وضعه في أحد الأطباق المتبلورة ، ثم اقلب الطبق بسرعة على كرة القطن بحيث يكون للفأر مساحة صغيرة لاستنشاق التخدير. راقب معدل تنفس الماوس وتأكد من أن الماوس تحت التخدير بشكل فعال.
   ملاحظه: يجب أن يكون معدل التنفس أبطأ وأعمق ، والذيل مترهل ، والكفوف لا تستجيب لاختبار القرص تحت التخدير ؛ انظر إرشادات IACUC للحصول على تفاصيل إضافية.
4. أثناء خضوع الفأر للتخدير (يستغرق ذلك من 1 إلى 2 دقيقة) ، قم بإعداد برميل حقنة سعة 10 مل عن طريق سحب المكبس وإدخال كرة قطنية صغيرة. أضف 1-2 مل من الأيزوفلوران بنسبة 30٪ مع ماصة نقل إلى كرة القطن داخل البرميل وضع البرميل مفتوحا لأسفل على طاولة أثناء انتظار فقدان الفأر للوعي.
5. انزع الطبق المتبلور بسرعة ، واقلب الماوس على ظهره وضع برميل المحقنة على أنفه. تحقق جيدا من معدل التنفس وقرص إصبع القدم والذيل المترهل. تشير أي استجابات لقرصة إصبع القدم والذيل المترهل إلى أن الفأر ليس تحت التخدير بالكامل. احتفظ برميل المحقنة فوق الخطم للحفاظ على فقدان الوعي.
6. ضع مسامير الإبهام من خلال أقدام الفأر ، مع تمديد الأطراف في وضع ضعيف. بلل البطن والقفص الصدري بنسبة 70٪ من الأيزوبروبانول أو الإيثانول.
7. باستخدام ملقط مستقيم في يد واحدة ، ارفع الجلد بالقرب من قاعدة البطن. باستخدام المقص في اليد الأخرى ، قم بقص جلد الخيام والصفاق. يجب أن يكون الشق أفقيا أو عبر قاعدة جلد الخيام. تأكد من قطع جميع طبقات الجلد والصفاق من أجل الوصول إلى الأمعاء. قطع جانبيا حول البطن حتى القفص الصدري على كلا الجانبين دون قطع أي من الأعضاء.
8. اقطع سديلة الجلد عن طريق قطع القفص الصدري السفلي. حرك الأمعاء إلى اليمين مع الجزء الخلفي من الملقط لكشف الوريد البابي.
   ملاحظه: يجب أن يكون النزيف من ضئيلا ؛ يجب أن يظل يتنفس وتحت التخدير العميق.
9. ضع الملقط المنحني المغلق أسفل الوريد البابي بين الكبد والوريد البنكرياس والاثني عشر العلوي (الشكل 2 السهم).
10. افتح الملقط تحت الوريد البابي. أمسك الخيط واسحبه بحذر بحيث يتمركز أسفل الوريد البابي. اربط عقدة علوية حول الوريد البابي دون ربطها.
11. ضع الملقط المنحني أسفل الوريد البابي واسحبه برفق باتجاه ذيل الماوس لتصويب الوريد (الشكل 3 أ).
12. مع وجود القسطرة في اليد الأخرى ، ضع شطبة الإبرة متجها لأعلى وبالتوازي مع الجزء السفلي من الوريد البابي بالقرب من الملقط (الشكل 3 ب).
13. ثقب الوريد برفق بالإبرة (الشكل 3 ج). تأكد من أن شطبة الإبرة في تجويف الوريد. اسحب الإبرة المحملة بنابض واستمر في دفع قسطرة البوليمر عبر الوريد حتى يصبح الشطبة بالقرب من المنطقة المتفرعة الوريدية. هذا داخل الكبد. إذا تم وضع القسطرة بشكل صحيح ، فسيكون التدفق العكسي للدم مرئيا. (الشكل 3 د).
14. شد العقدة العلوية واسحبها لأسفل على القسطرة للمساعدة في تثبيتها. قم بخفض معدل المضخة على الفور من 20 مل / دقيقة إلى 4 مل / دقيقة وقطع وعاء دموي رئيسي آخر للتصريف. قطع الشريان الأورطي البطني للحصول على أفضل النتائج.
15. ضع الطرف الذكري للأنبوب في الطرف الأنثوي للقسطرة (الشكل 4 أ). تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الخط. كن حذرا من عدم دفع القسطرة إلى الكبد أو خارج الوريد. وضع الخيط ليس ضروريا ، على الرغم من أنه يساعد على منع التدفق العكسي للخروج من الوريد ويساعد في الحفاظ على القسطرة في الموضع الصحيح (الشكل 4 ب ، ج).
16. استخدم شريطا لاصقا لتثبيت الأنبوب على الوسادة السفلية. استخدم الملقط المستقيم للضغط على الأوعية الدموية السائلة لتضخيم الكبد عدة مرات لضمان تصريف الدم بالكامل (الشكل 4 د).
    ملاحظه: قد لا يعمل شريط المختبر القياسي. ومع ذلك ، سيظل الشريط اللاصق عالقا في الوسادة السفلية ، حتى في الظروف الرطبة.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تروية الكبد

1. أثناء تدفق الكبد باستخدام PBS ، قم بقياس حوالي 24 مجم من الكولاجيناز من النوع الرابع وضعه في قارورة تحتوي على 45 مل من Buffer 2 في الحمام المائي. تأكد من تحريك السائل في القارورة حتى يذوب الكولاجيناز تماما ووضع القارورة مرة أخرى في المشبك بحيث يتم غمر السائل الذي يحتوي على جزء من القارورة بالكامل في الماء.
2. لاحظ التغير في لون الكبد أثناء غسله باستخدام PBS. قم بتغيير أنبوب التدفق الخارجي من قارورة سعة 1 لتر إلى قارورة سعة 125 مل. لا تسمح لفقاعات الهواء بالتدفق إلى الكبد.
3. بمجرد وصول المحلول المؤقت للتروية إلى الكبد ، اضغط لفترة وجيزة على الأوعية الدموية السائلة لبناء بعض الضغط داخل الوعاء والسماح لهذا السائل بملء جميع فصوص الكبد. تأكد من عدم قطع الصرف لفترة طويلة ، فقد يؤدي ذلك إلى انفجار النسيج الضام الرقيق المحيط بالكبد (كبسولة جليسون) وتدمير نضح أو تدفق السائل داخل السرير الشعري للكبد.
4. اسمح للمخزن المؤقت 2 مع الكولاجيناز بالانتشار عبر الكبد حتى يتدفق كل 45 مل عبر الأنسجة.
   ملاحظه: إذا نجحت ، يجب فصل كبسولة جليسون عن الحمة أو أنسجة الكبد ويجب أن يبدو الكبد نفسه غير متبلور.
5. أضف حوالي 10 مل من Buffer 1 إلى طبق البلورة الآخر وضعه بجوار الماوس.
6. قم بإزالة القسطرة وإيقاف تشغيل المضخة.
7. باستخدام الملقط والمقص المستقيم ، اقطع الكبد من الماوس. إذا كان هضم الكولاجيناز فعالا للغاية ، فقد يكون من الضروري وجود ملعقة نظيفة ومعقمة في متناول اليد لإخراج الكبد من الفأر ووضعه في Buffer 1.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لمجموعة التروية. يتم تثبيت القوارير في مكانها بواسطة المشابك (غير معروضة) ؛ يتم تبديل الأنبوب المحتوي على السائل من قارورة 1 لتر إلى قارورة 125 مل أثناء الإجراء يتم تمثيلها بالخط الأحمر المنقط. لاحظ أن تغذية الأكسجين لا تتدفق مباشرة في المحاليل الموجودة في القوارير. يجب أيضا إحراز الفلين للسماح بتدفق سائل الدائرة المغلقة مع إدخال الأنبوب داخل الشق....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 لتر قارورة إرلينماير فيشر ساينتيك س 63274 250 مل قارورة إرلينماير فيشر ساينتيك الطراز S63271 أنابيب سيليكون كول بارمر 96400-14 يمتد هذا الأنبوب من القوارير عبر المضخة إلى الموصل T ثم إلى المحقنة سعة 1.0 مل المتصلة بالقسطرة. أنابيب Tygon فيشر ساينتيك التوصية 3603 يستخدم كمحول بين 96400-14 والماصات والموصل T. يمكن استخدام هذا أيضا لأنابيب الأكسجين. موصلات T كول بارمر EW-06294-82 قطع الاتصال السريع فيشر ساينتيك 6150-0010 قرصة المشابك فيشر ساينتيك 6165-0002 مضخة ماسترفلكس L / S متغيرة السرعة ؛ موديل 7553-70 كول بارمر EW-07559-00 مضخة periplastic مع سرعة متغيرة رأس المضخة موديل 7014-20 كول بارمر EW-07014-20 ماصات زجاجية متدرجة سعة 1.0 مل فيشر ساينتيك 13-678 مقص منحني غير مسنن أدوات العلوم الدقيقة 14069-12 ملقط دومون أدوات العلوم الدقيقة 11252-20 ملقط منحني أدوات العلوم الدقيقة 13009-12 حقنة 10 مل فيشر ساينتيك 03-377-23 ستكون هناك حاجة فقط إلى برميل من المحقنة ملعقة معقمة متجر مستلزمات المنزل كرة (كروات) قطنية متجر مستلزمات المنزل خيوط خياطة بوليستر متجر مستلزمات المنزل شريط لاصق متجر مستلزمات المنزل مسامير الإبهام متجر مستلزمات المنزل وسادة الستايروفوم رف مخروطي 50 مل ملف تعريف الارتباط / ورقة الخبز متجر مستلزمات المنزل وسادات سفلية ماصة فيشر ساينتيك 14-206-64 حمام مائي سعة 19 لتر فيشر ساينتيك TSCOL19 BD Insyte Autogaurd القسطرة الرباعية المحمية 24 قياس بيكتون ديكنسون 381412 قسطرة بلاستيكية بإبرة قابلة للسحب أطباق تبلور 100 × 50 VWR 89000-290 أطباق بتري البوليسترين سيجما ألدريتش P5481-500EA 50 مل أنابيب مخروطية فيشر ساينتيك 12-565-270 الماصات المتدرجة (5 مل) فيشر ساينتيك 170355 الماصات المتدرجة (25 مل) فيشر ساينتيك 170357 EasyStrainer 100 ميكرومتر Greiner bio-one 542000 مرشح 100 ميكرومتر EasyStrainer 40 ميكرومتر Greiner bio-one 542040 مرشح 40 ميكرومتر الكواشف اسم مركب جرام (جم / لتر) ملي مولار (ملليمتر) العازلة 1 ؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 كلوريد الصوديوم 8.3 142 كيه سي إل 0.5 6.7 ب هيبس 2.4 10 جيش صرب البوسنه 15 0.226 العازلة 2 ؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 كلوريد الصوديوم 3.9 66.74 دولار كيه سي إل 0.5 6.71 دولار CaCl2 0.7 6.31 دولار هيبس 24 100 جيش صرب البوسنه 15 0.226 الفينول الأحمر 0.01 0.03 PBS ؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 كلوريد الصوديوم 8 137 كيه سي إل 0.2 2.7 [إ] Na2HPO4-7H2O 1.15 دولار 4.3 كيه 2 ب 4 0.2 1.4 كواشف أخرى اسم شركة رقم الكتالوج التعليقات الكولاجيناز النوع الرابع سيجما ألدريتش ج 5138 إيزوفلوران أبكام أب144581