فحص البلعمة الدبقية الدقيقة: اختبار في المختبر لإنشاء نموذج البلعمة الدبقية الدقيقة لخلايا الورم الأرومي العصبي باستخدام البلاعم iPSC

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Hall-Roberts ، H. et al. في المختبر فحص التصوير الكمي للبلعمة لخلايا الورم الأرومي العصبي الميتة بواسطة iPSC-Macrophages. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نجري اختبار البلعمة الدبقية الدقيقة للورم الأرومي العصبي باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. يساعد الاختبار في تقييم ضعف وظيفة الخلايا الدبقية الدقيقة في الأمراض التنكسية العصبية.

البروتوكول

فئة

1. وضع العلامات على SH-SY5Ys الميت بصبغة فلورية حمراء حساسة للأس الهيدروجيني

1. ابدأ بخلايا SH-SY5Y الثابتة المعلقة في وسائط HEPES الخالية من الفينول باللون الأحمر. عد الخلايا وقم بإزالة العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة في أنبوب منخفض البروتين سعة 2 مل. لكل 1 مليون SH-SY5Y ، قم بتكوين الحجم الإجمالي في أنبوب 2 مل إلى 300-500 ميكرولتر باستخدام وسائط مخزنة خالية من الفينول باللون الأحمر. قم بتسخين الأنبوب لفترة وجيزة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. أعد تكوين إستر STP للصبغة الفلورية الحمراء الحساسة للأس الهيدروجيني (انظر جدول المواد) وأضف 12.5 ميكروغرام من الصبغة لكل مليون SH-SY5Y إلى أنبوب الخلايا الدافئ 2 مل. تخلط بلطف عن طريق سحب العينات. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، محميا من الضوء.
   ملاحظه: تتفاعل أنواع إستر STP من الصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني مع الأمينات الأولية ، وبالتالي ، يجب ألا يحتوي المخزن المؤقت لوضع العلامات على أمينات حرة. نظرا للذوبان المحدود المحتمل في المخازن المؤقتة المائية ، أضف الصبغة الذائبة DMSO فقط لتسخين المخزن المؤقت المائي ، واخلطه على الفور ، وافحص علامات الترسيب (الجسيمات الداكنة تحت المجهر الضوئي).
3. أضف 1 مل من HBSS وجهاز الطرد المركزي عند 1200 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسلها ب 2 مل HBSS. كرر الطرد المركزي.
4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسط البلاعم الخالي من الفينول (انظر جدول المواد) إلى تركيز 200,000-1.2 مليون خلية / مل بحيث يكون 50 ميكرولتر 10,000-60,000 خلية (أي 0.5x-3x أكثر من SH-SY5Ys من iPSC-macrophages).
   ملاحظه: يزيد الفينول الأحمر في الوسائط من تألق الخلفية ، وبالتالي ، يجب استخدام الوسائط الخالية من الفينول الأحمر إذا كان سيتم إجراء تصوير الخلايا الحية. لا ينصح بتخزين SH-SY5Ys الملطخة لأكثر من بضع ساعات لأنه لم يتم تقييم ذلك. احتفظ ب SH-SY5Ys الملطخة على الجليد واحميها من الضوء.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تلطيخ iPSC-macrophages

1. في خزانة السلامة البيولوجية ، قم بإعداد محلول في وسط البلاعم لصبغة فلورية حمراء عميقة ، نفاذة للخلية ، تفاعل إستر السكسينيميديل (انظر جدول المواد). أضف Hoechst 33342 (انظر جدول المواد). قم بتسخين محلول العمل إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
2. قم بشفط وسط iPSC-macrophage برفق عن طريق سحب المادة الطافية للخلية باستخدام ماصة متعددة القنوات في خزان معقم. أضف 70 ميكرولتر/بئر من محلول الصبغة المحضر في الخطوة 2.1 إلى البلاعم iPSC، باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. تحضير العلاجات التجريبية في وسط البلاعم الخالي من الفينول الأحمر. قم بتضمين 10 ميكرومتر من السيتوكالاسين D كعلاج تحكم سلبي. بعد الحضانة، قم بشفط وسط iPSC-macrophage برفق شديد باستخدام ماصة متعددة القنوات وأضف 100 ميكرولتر/بئر من محلول هانك الملحي المخزن (HBSS) للغسيل. قم بإزالة HBSS على الفور عن طريق سحب العينات اللطيف، ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسائط ± المركبات. احتضان لمدة 10 دقائق - 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: السيتوكالاسين D هو مثبط فعال للأكتين ويمنع البلعمة. بالنسبة لأي علاجات تجريبية تتطلب حضانة أطول ، على سبيل المثال ، 24-72 ساعة ، قم بإجراء العلاج التجريبي قبل الخطوة 2.1 ، باستخدام 100 ميكرولتر / بئر من المعالجة في وسط البلاعم الكامل. اتبع الخطوات 2.1-2.3 وفقا للبروتوكول بحيث يتم إجراء تلطيخ الخلايا وبعد ذلك يتم إعادة تطبيق العلاج في وسط البلاعم الخالي من الفينول الأحمر لبقية مقايسة البلعمة.

< p class = "jove_title" >3. تصوير البلعمة

1. التصوير عالي المحتوى للخلايا الثابتة
   1. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من SH-SY5Ys المسمى لكل بئر، مع إضافتها إلى جانب كل بئر على حافة السائل. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 3-5 ساعات.
   2. بعد حضانة البلعمة، قم بشفط الخلايا الطافية برفق عن طريق سحب العينات باستخدام ماصة متعددة القنوات، وتخلص منها. يغسل مرة واحدة باستخدام 100 ميكرولتر PBS.
   3. قم بتثبيت اللوحة بإضافة 100 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهايد واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   4. شفط الآبار وإضافة 100 ميكرولتر من PBS. غطيها بمادة مانعة للتسرب ورقائق معدنية. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة.
      ملاحظه: يمكن تخزين لوحة الفحص على هذا النحو لمدة أسبوع على الأقل دون تدهور كبير في الإشارة ؛ لم يتم اختبار التخزين الأطول.
   5. قم بتشغيل مجهر التصوير عالي المحتوى (انظر جدول المواد) وافتح برنامج التقاط الصور. قم بتحميل لوحة الفحص في المجهر بالنقر فوق أيقونة التحميل في الجزء العلوي من الشاشة.
   6. حدد علامة التبويب إعداد. في القوائم المنسدلة في المربع العلوي الأيسر: حدد نوع اللوحة المناسب ، وحدد خيار التركيز البؤري التلقائي اثنين من الذروة (افتراضي) ، وحدد الهدف 40x Water ، NA1.1 ، وحدد الوضع متحد البؤرة ، وحدد binning of 1.
   7. اغسل هدف الماء 40x قبل الاستخدام عبر قائمة الإعدادات.
   8. في مربع تحديد القناة، استخدم أيقونة + لإضافة القنوات DAPI وAlexa 647 وAlexa 568. اضبطها على مستوى واحد 1 ميكرومتر. تحسين إعدادات الوقت والطاقة لكفاءة تلطيخ لوحة الفحص.
      ملاحظه: كمبدأ توجيهي ، قم بتعيين DAPI عند تعرض 200 مللي ثانية وطاقة 100٪ ، و Alexa 647 عند تعرض 1500 مللي ثانية وطاقة 100٪ ، و Alexa 568 عند تعرض 100 مللي ثانية و 40٪ من الطاقة.
   9. تأكد من عدم قياس القنوات في وقت واحد بالنقر فوق تسلسل القناة لفصل القنوات.
   10. تحت التنقل | حدد التخطيط ، وحدد آبار القياس وحدد 9-12 حقلا لكل بئر.
   11. أثناء الإعداد ، انقر فوق حقل تمثيلي على خريطة اللوحة ، وتحقق من كل قناة قياس بدورها ، للتأكد من وجود التلوين وتركيز الصور ، عن طريق ضبط إزاحة القناة.
   12. لتحميل البيانات إلى خادم لتحليلها عن بعد ، انقر فوق مربع الوظائف عبر الإنترنت واسم الشاشة ذي الصلة ؛ سيؤدي ذلك إلى تمكين التحميل التلقائي للبيانات إلى الخادم بعد التصوير.
   13. احفظ بروتوكول الفحص بالنقر فوق الزر حفظ.
   14. انقر فوق علامة التبويب "تشغيل التجربة" في الجزء العلوي وقم بتسمية لوحة التجربة ، ثم انقر فوق ابدأ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل 15 مل	صقر	352096	للطرد المركزي للخلايا
2-20 ميكرولتر ، 20-200 ميكرولتر ، 100-1000 ميكرولتر ماصات دقيقة أحادية القناة
4٪ بارافورمالدهيد في PBS	ألفا إيسار	J61899	لتثبيت الخلايا
لوحة 6 آبار ، معالجة ثقافة الأنسجة
AggreWell-800 لوحة 24 بئر	تقنيات STEMCELL	34815	صفيحة Microwell منخفضة الالتصاق 24 بئرا لتشكيل الأجسام الجنينية
عداد الخلايا الآلي
جهاز طرد مركزي على الطاولة
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة
CellCarrier-96 Ultra Microplates ، معالجة بزراعة الأنسجة ، أسود ، 96 بئر مع غطاء	بيركين إلمر	6055302	96 بئر مزرعة الأنسجة (TC) صفيحة مجهرية معالجة مع جدران بئر سوداء وقاع واضح بصريا ، لفحص البلعمة
برنامج CellProfiler			برنامج مفتوح المصدر لتحليل صور البلعمة التي تم الحصول عليها بواسطة مجهر الخلية الحية بفاصل زمني. قم بالتنزيل مجانا من موقع الويب (http://cellprofiler.org/) ، استخدم هذا البروتوكول الإصدار 2.2.0.
صبغة CellTracker حمراء عميقة	ثيرمو فيشر	سي 34565	صبغة فلورية حمراء عميقة ، نفاذة للخلايا ، صبغة تفاعلية إستر السكسينيميديل لتلوين السيتوبلازم من البلاعم iPS. قم بإذابة صبغة CellTracker Deep Red في DMSO إلى 2 ملي مولار (1.4 مجم / مل). استخدم عند 1 ميكرومتر ، عن طريق تخفيف مخزون DMSO باستخدام وسائط البلاعم.
خزانة أمان تدفق الهواء الصفحي من الفئة 2
زجاجة غاز CO2			ملحق EVOS FL Auto
حاضنة CO2 ، مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2
السيتوكالاسين د	كايمان	هاتف 11330	علاج التحكم السلبي لمقايسة البلعمة. أعد التكوين في DMSO إلى 10 ملي مولار وقم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية ، وتجنب المزيد من دورات التجميد والذوبان. استخدم بالتركيز النهائي 10 ميكرومتر.
DMEM / F12	جيبكو	11320074	مكون من وسائط SH-SY5Y
DMSO	سيغما	د8418	مذيب لأصباغ CellTracker و pHrodo
مصل الأبقار الجنينية	سيغما	F4135	مكون من وسائط SH-SY5Y
مصفوفة غشاء أساسي خالية من Geltrex LDEV ، مؤهلة من hESC ، منخفضة عامل النمو	إنفيتروجين	A1413302	مصفوفة غشاء القاعد المؤهلة من hESC لثقافة iPSC
مكمل GlutaMAX	جيبكو	35050-038	مكون من كل من وسائط المصنع والبلاعم
HBSS	لونزا	كن 10-547F	محلول الملح المتوازن من هانك لخطوات الغسيل
المؤتلف البشري IL-3	جيبكو	PHC0033	مكون من كل من وسائط المصنع والبلاعم
حل تصوير الخلايا الحية	ثيرمو فيشر	A14291DJ	وسائط مخزنة باللون الأحمر من الفينول لوضع العلامات على SH-SY5Ys الميتة
أنابيب ملزمة منخفضة البروتين 2 مل	إيبندورف	30108.132	لتلطيخ SH-SY5Ys
M-CSF	ثيرمو فيشر	PHC9501	مكون من كل من وسائط المصنع والبلاعم
mTeSR1 متوسط	تقنيات STEMCELL	85850	وسائط iPSC
ماصة متعددة القنوات 20-200 ميكرولتر			لمناولة السوائل للوحة 96 بئرا
كاشف NucBlue Live ReadyProbes	ثيرمو فيشر	R37605	تركيبة Hoechst 33342 في زجاجة قطارة لتلوين نوى البلاعم iPS ، استخدم 0.5 قطرة / مل في وسائط البلاعم.
نظام فحص المحتوى العالي Opera Phenix	بيركين إلمر	HH14000000	مجهر تصوير عالي المحتوى، يستخدم مع الإصدار 4.9 من برنامج Harmony.
البنسلين - ستربتومايسين	جيبكو	15140-122	مكون من وسائط المصنع والبلاعم و SH-SY5Y
فرودو آي إف إل أحمر STP-Ester	ثيرمو فيشر	P36011	صبغة فلورسنت حمراء حساسة للأس الهيدروجيني لوضع العلامات على SH-SY5Ys الميتة. أعد تكوين مسحوق pHrodo iFL Red STP Ester في DMSO بتركيز 5 مجم / مل. لكل 1 مليون SH-SY5Ys ، أضف 2.5 ميكرولتر (12.5 ميكروجرام) من مخزون pHrodo iFL Red STP Ester إلى الخلايا الدافئة مسبقا المعلقة في محلول تصوير الخلايا الحية.
حشو الماصة المصلية
قارورة T175 ، معالجة زراعة الأنسجة			وعاء للتمايز بين سلائف iPSC-البلاعم, المعروفة باسم "المصانع"
قارورة T75			وعاء لثقافة SH-SY5Y
سدادات الألواح الشفافة	غرينر بيو ون	676001	لتخزين لوحة الفحص ونقلها
حمام مائي، ضبط على 37 درجة مئوية
X-VIVO 15 متوسط مع L-glutamine والجنتاميسين وأحمر الفينول	لونزا	BE04-418F	مكون من وسائط المصنع والبلاعم
X-VIVO 15 متوسط مع L-glutamine ؛ بدون جنتاميسين أو فينول أحمر	لونزا	04-744س	وسائط البلاعم الخالية من الفينول الأحمر ، للاستخدام في البلعمة بدون إضافات أو عوامل نمو