عزل النوى من أنسجة الورم الدبقي المجمدة الطازجة: طريقة للحصول على نوى سليمة من عينات الورم الدبقي

الملخص

المصدر: Narayanan، A. et al. عزل النوى عن أورام الدماغ المجمدة الطازجة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة و ATAC-seq. J. Vis. Exp. (2020)

يصف هذا الفيديو بروتوكول عزل النوى المفردة من أنسجة الورم الدبقي المجمد الطازجة. يمكن استخدام النوى المفردة المعزولة كعينات لتقنيات التسلسل مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA) ومقايسة النواة المفردة لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر النواة (snATAC) للحصول على رؤى أعمق حول عدم التجانس بين الورم وداخله الذي لوحظ في الورم الدبقي في الأنسجة العصبية المركزية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تشريح الأنسجة وتفككها

1. انقل عينة الأنسجة المجمدة الطازجة (10-60 مجم) إلى طبق بتري مبرد مسبقا. افرم / قطع الأنسجة المجمدة الطازجة بشفرة حلاقة إلى قطع صغيرة على الثلج.
2. أضف 500 ميكرولتر من محلول تحلل النوى المبرد إلى أنبوب 1.5 مل مبرد مسبقا. ضع قطع الأنسجة في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على المخزن المؤقت لتحلل النوى وانقلها إلى Douncer (جدول المواد).
   ملاحظه: هناك نوعان من مدقات الخالط Dounce: مدقة "فضفاضة" أو "A" لتقليل العينة الأولية ومدقة "ضيقة" أو "B" لتجانس العينة بالكامل.
3. قم بإخراج قطع المناديل بالمدقة "السائبة" لمدة 20 ضربة تقريبا ، حتى ينخفض الاحتكاك. في حالة وجود حطام ، يمكن تنظيف العينة مسبقا عن طريق الترشيح بمصفاة 100 مم.
4. انطلق باستخدام المدقة "الضيقة" لمدة 20 ضربة لتحقيق تجانس كامل للأنسجة.
5. انقل المتجانس (حوالي 500 ميكرولتر) إلى أنبوب مبرد مسبقا 2 مل. أضف 1 مل من محلول التحلل المبرد. تخلط بلطف وتحتضن على الثلج لمدة 5 دقائق. امزجها برفق باستخدام طرف ماصة عريض التجويف وكرر ذلك 1-2 مرات أثناء الحضانة.
6. قم بتصفية الجانسة بالكامل باستخدام شبكة مصفاة 30 ميكرومتر ، واجمعها في أنبوب فالكون سعة 15 مل وانقله مرة أخرى إلى أنبوب جديد مبرد مسبقا سعة 2 مل. عادة ما تكون مصفاة واحدة كافية للتجانس بأكمله.
7. تحقق تحت المجهر الضوئي للتحقق من إزالة الحطام الكبير وسلامة الغشاء النووي. يجب أن تكون النوى مستديرة ويجب عدم تشويه الغشاء النووي. في حالة وجود حطام ، يمكن إعادة تصفية النوى.
8. جهاز الطرد المركزي للنوى عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية على جهاز طرد مركزي على الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية ، تاركا وراءها ~ 50 ميكرولتر مع حبيبات تحتوي على النوى. أعد تعليق الحبيبات برفق في 1 مل أخرى من المخزن المؤقت لتحلل النوى واحتضانها لمدة 5 دقائق على الجليد.
9. الطرد المركزي للنوى عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات ، وأضف 500 مل من 1x المخزن المؤقت للتجانس (HB) (الجدول 1) واحتضنه لمدة 5 دقائق دون إعادة التعليق. بعد ذلك ، أعد تعليق النوى في 1.0 مل أخرى من 1x HB.
10. قم بالطرد المركزي للنوى عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق النوى برفق في 200 ميكرولتر من 1x HB في أنبوب جديد سعة 2.0 مل.

    الجدول 1: تحضير محلول غير مستقر عازلة التجانس 1x (2 مل لكل عينة)

    1x محلول غير مستقر للتجانس عازل (2 مل لكل عينة) الكاشف النهائي Conc. الحجم لكل عينة (ميكرولتر) 6x عازلة التجانس غير مستقرة 1x 333.33 دولار 1 م سكروز 320 ملي 640.00 50 ملي EDTA 0.1 ملي 4.00 10٪ NP40 0.1٪ 20.00 ح₂س 1006.27 [ا]

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2-ميركابتو إيثانول سيغما M6250 CaCl2 سيغما 21115-100 مل EDTA (0.5 م) الترمو: العلمية R1021 Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية فيشر ساينتيك 352096 مصافي MACS الذكية (100 ميكرومتر) ميلتيني بيوتيك 130-098-463 ملغ (تيار متردد) 2 سيغما 63052-100 مل NP-40 أبكام أب142227 طقم عزل النوى: Nuclei EZ Prep سيغما NUC101-1 كيلو طن أنابيب القفل الآمن 1.5 مل إيبندورف 30120086 أنابيب قفل آمنة 2.0 مل إيبندورف 30120094 سكروز سيغما S0389 أطراف ماصة واسعة التجويف (1000 ميكرولتر) ثيمو فيشر العلمي 2079جي بي كي