مقالة منهجية

تنقية النوى القائمة على الطرد المركزي المتدرج: تقنية للحصول على جزء فائق النقاء من النوى السليمة باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Narayanan ، A. et al. عزل النوى من أورام الدماغ المجمدة الطازجة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة و ATAC-seq. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا بسيطا وفعالا باستخدام الطرد المركزي المتدرج لعزل النوى المفردة. بمجرد عزلها ، يمكن استخدام هذه النوى للتسلسل وتحليل الجينوم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. الطرد المركزي المتدرج

  1. أضف 200 ميكرولتر من محلول اليوديكسانول بنسبة 50٪ (الجدول 1) لإعطاء تركيز نهائي بنسبة 25٪ يوديكسانول. تخلط جيدا 10 مرات باستخدام ماصة مثبتة على 300 مل.
  2. أضف 300 ميكرولتر من محلول اليوديكسانول 29٪ (الجدول 2) تحت خليط 25٪. استخدم طرفا ناعما P1000 لتجنب خلط الطبقات.
  3. أضف 300 ميكرولتر من محلول اليوديكسانول بنسبة 35٪ (الجدول 3) تحت خليط 29٪. استخدم طرفا ناعما P1000 لتجنب خلط الطبقات.
    أنذر: تتطلب هذه الخطوة الإزالة التدريجية لطرف الماصة أثناء سحب العينات لتجنب إزاحة الحجم الزائد.
  4. ضع العينات في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح ، وقم بالدوران لمدة 20 دقيقة عند 3,500 × جم عند 4 درجات مئوية مع إيقاف تشغيل الفرامل.
  5. قم بإزالة العينات برفق دون اهتزاز وراقبها تحت الضوء. يجب أن يكون شريط أبيض شفاف من نوى نقية بنسبة 95٪ مرئيا بين الطبقة الثانية والثالثة (الشكل 1).
< p class = "jove_title" >2. عزل النوى

  1. استنشق الطبقات العليا حتى النوى البيضاء عند الطور البيني من 29٪ -35٪.
  2. اجمع نطاق النوى بحجم 200 مل ، وانقله إلى أنبوب جديد ، وقم بالتصفية بمرشح 20 ميكرومتر (جدول المواد).
    ملاحظه: لا تحتاج النوى إلى إعادة التعليق قبل الترشيح.
  3. تحقق تحت المجهر الضوئي للتحقق من إزالة الحطام الكبير وسلامة الغشاء النووي. يجب أن تكون النوى مستديرة ، ويجب عدم تشويه الغشاء النووي.
  4. عد النوى باستخدام تلطيخ Trypan الأزرق على مقياس كثافة الدم ونواة aliquot ل snRNA-seq / snATAC-seq.

الجدول 1: تحضير 6x Homogenization Buffer Stable Master Mix

6x مزيج رئيسي مستقر للعازلة التجانس الكاشف النهائي Conc. حجم 100 (مل) 1 م CaCl₂ 30 ملم 3.0 1 مليون ملغ (تيار متردد)₂ 18 ملي 1.8 ب 1 م تريس الرقم الهيدروجيني 7.8 60 ملم 6.0 H₂O 89.2 دولار يحفظ في درجة حرارة الغرفة ، وتجنب التعرض المباشر للضوء

الجدول 2: تحضير 1 م من السكروز

1 م سكروز 34.23 جرام سكروز يذوب في 78.5 مل من الماء املأ ما يصل إلى 100 مل بالماء

الجدول 3: تحضير محلول غير مستقر عازلة التجانس 6x (650 ميكرولتر لكل عينة)

6x محلول غير مستقر لمخزن التجانس (650 مل لكل عينة) الكاشف النهائي Conc. الحجم لكل عينة (ميكرولتر) 6x التجانس عازلة مستقرة 6 أضعاف 648.84 100 ملي مولار PMSF (فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل) 0.1 ملي 1.08 14.3 م β-mercaptoethanol 1 ملي متر 0.08

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: مخطط انسيابي لعزل النوى. يوفر مخطط التدفق نظرة موجزة على الخطوات المتضمنة في عزل النوى المفردة من أنسجة الورم الدبقي المجمد الطازجة. تظهر الصور التمثيلية لعينة الورم والشريط النووي بعد تدرج اليوديكسانول / السكروز (محاط بدائرة بخط أحمر منقط

).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات EDTA (0.5 م) الترمو: العلمية R1021 فالكون 15 مل جهاز طرد مركزي مخروطي
انابيب فيشر ساينتيك 352096 اليوديكسانول (المعروف أيضا باسم Optiprep) تقنيات الخلايا الجذعية 07820 NP-40 أبكام أب142227 أنابيب القفل الآمن 1.5 مل إيبندورف 0030120086 أنابيب قفل آمنة 2.0 مل إيبندورف 0030120094 سكروز سيغما S0389 أطراف ماصة واسعة التجويف (1000 ميكرولتر) ثيمو فيشر العلمي 2079جي بي كي أطراف ماصة عريضة التجويف (200 ميكرولتر) ثيمو فيشر العلمي 2069جي بي كي

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة