$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. تثبيت وتلوين أقسام أنسجة المخ المحفوظة بالتبريد
- للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي ، قم بتنظيف جميع الأدوات لاستخدامها مع محلول تنظيف RNase. تابع بروتوكول التثبيت والتلوين داخل غطاء الدخان.
- قم بإعداد المحاليل المثبتة الموصوفة في أنابيب نظيفة خالية من RNase سعة 50 مل. اصنع جميع المحاليل بالماء الخالي من RNase في يوم التلوين.
- في نفس اليوم سيتم إجراء التشريح الدقيق بالليزر ، وإعداد محاليل الإيثانول بنسبة 100٪ و 95٪ و 70٪ و 50٪. احتفظ بالمحاليل في أنابيب مغلقة بإحكام في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير 4٪ كريسيل بنفسجي و 0.5٪ يوزين Y في محلول الإيثانول 75٪. قم بتدوير المحلول بقوة لمدة 1 دقيقة وقم بتصفيته من خلال مرشح نايلون 0.45 ميكرومتر للتخلص من آثار المسحوق غير المذاب.
- ضع شرائح الأنسجة في وعاء يحتوي على 95٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية. انقل الشرائح إلى الأنبوب الذي يحتوي على 75٪ إيثانول ؛ اترك الشرائح هناك لمدة 30 ثانية.
- انقل الشرائح إلى 50٪ من الإيثانول واتركها هناك لمدة 25 ثانية. في هذه المرحلة ، سيتم حل OCT. انقل الشريحة إلى محلول كريسيل البنفسجي 4٪ لمدة 20 ثانية ثم انقلها إلى محلول اليوزين Y بنسبة 0.5٪ لمدة 5 ثوان.
- أخرج الشريحة من محلول الصبغة وامسح الشريحة حتى تجف بورق ترشيح. ثم ضع الشرائح في 50٪ من الإيثانول لمدة 25 ثانية. انقل الشرائح إلى 75٪ إيثانول لمدة 25 ثانية. انقل الشرائح إلى 95٪ إيثانول لمدة 30 ثانية. انقل الشرائح إلى 100٪ إيثانول لمدة 60 ثانية.
- شطف الشريحة مع الزيلين. انقلها إلى وعاء به زيلين وانتظر 3 دقائق.
- تحضير وسط التركيب (على سبيل المثال ، اللثة الدقيقة) في الماء الخالي من RNase. لتركيب أقسام دماغ الفأر ، قم بتخفيف وسط التركيب في الماء الخالي من RNase بنسبة 1:10.
- جفف الشرائح على سطح خال من RNase في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثوان. قبل أن يجف الزيلين ، انتقل إلى تركيب الشرائح مع أقسام الأنسجة.
- قم بتفريق محلول التثبيت برفق فوق المناديل الورقية الموجودة على الشريحة باستخدام فرشاة رسم رفيعة معقمة وخالية من RNase. انتظر من 10 إلى 20 ثانية ثم انقل شرائح الأنسجة على الفور إلى منصة التشريح المجهري.
ملاحظة: تختلف نسبة الماء الخالي من RNase إلى الماء الخالي من RNase المستخدم في التركيب اعتمادا على الأنسجة التي تهمك. تحافظ نسبة الوسط / الماء المتصاعدة على مورفولوجيا أنسجة الورم الدبقي للتشريح الدقيق بالليزر دون التأثير على سلامة الحمض النووي الريبي.