$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير تعليق خلية واحدة من الدماغ
- وسط تدرج الكثافة المخفف بنسبة 9: 1 مع PBS في أنبوب مخروطي 15 مل لإنتاج محلول نهائي بنسبة 100٪.
- تخدير الفئران في ذروة EAE بحقن داخل الصفاق بنسبة 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (50 مجم / كجم) وتصفيه داخل القلب مع 20 مل من PBS المعقم المثلج. حقق ذلك عن طريق حقن PBS ببطء وثبات في البطين الأيسر للقلب باستخدام حقنة سعة 20 مل وفتح الأذين الأيمن.
- اقطع الجمجمة بعناية من الأنف إلى الرقبة ، ثم قم بإزالة الدماغ من صندوق الجمجمة إلى 10 مل من RPMI في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. تخلط جيدا لإزالة خلايا الدم الحمراء الملتصقة. ثم قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط وأضف 10 مل من RPMI.
- ضع الدماغ والوسط في طبق 100 مم. نقطع ناعما بشفرة حلاقة.
- انقل 6 مل من الطبق إلى الخالط الزجاجي الملبد سعة 7 مل باستخدام ماصة نظيفة. تجنب ترك كميات كبيرة من الأنسجة في الماصة. كمية صغيرة أمر لا مفر منه.
قم - بطحن الدماغ باستخدام المكبس "السائب" للمدقة أولا ، ثم استخدم المكبس "الضيق" حتى يصبح التعليق متجانسا واسكبه في أنبوب مخروطي مبرد مسبقا سعة 15 مل واستمر في وضع الثلج.
- بعد تجانس جميع العينات ، قم بتقدير الحجم. اضبط مستوى الصوت باستخدام RPMI إلى 7 مل. بعد ذلك ، ضع 3 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي المثلجة بنسبة 100٪ في أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل مبرد سعة 15 مل وأضف 7 مل من تجانس الدماغ للحصول على وسط تدرج نهائي بنسبة 30٪. امزج عن طريق الانعكاس عدة مرات. لا تدوام.
- لضمان واجهة حادة، أضف بعناية وببطء 1 مل من وسط تدرج كثافة الأساس 70٪ في RPMI باستخدام ماصة سعة 3 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة فقط عند 4 درجات مئوية. اضبط التسارع على 1 والتباطؤ على 0. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط كل المرحلة العليا تقريبا ، مع الحرص على إزالة المايلين تماما في الأعلى (الشكل 1).
- قم بإزالة الواجهة في أنبوب طرد مركزي جديد 15. اضبط مستوى الصوت على 10 مل باستخدام RPMI.
- جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، استنشق المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في ~ 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلوين قياس التدفق الخلوي (FSC).
