مقالة منهجية

استخراج الببتيدات الموجود في Ubiquitinylated على أساس التقارب المناعي: تقنية لاستخراج الببتيدات الموسومة باليوبيكويتين بشكل انتقائي من كسور الببتيد المنقاة

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Bezstarosti، K. et al. الكشف عن مواقع انتشار البروتين في كل مكان عن طريق تخصيب الببتيد وقياس الطيف الكتلي. J. Vis. Exp. (2020)

يصف هذا الفيديو طريقة لاستخراج وتنقية الببتيدات الموجودة في كل مكان تحتوي على ببتيدات ثنائي جلايسين متبقية من خليط ببتيد معقد. قد تساعد الطريقة المقدمة في تحديد مواقع الانتشار الأصلية في البروتين.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. استخراج الببتيدات في Ubiquitinylated

  1. استخدم كروماتوغرافيا الطور العكسي عالية الأس الهيدروجيني (RP) C18 مع مادة الطور البوليمري الثابتة (300 Å ، 50 ميكرومتر ؛ انظر جدول المواد) محملة في خرطوشة عمود فارغة لتجزئة الببتيدات التريبتي. يجب تعديل حجم سرير المرحلة الثابتة وفقا لكمية هضم البروتين المراد تقسيمها. قم بإعداد خرطوشة عمود فارغة سعة 6 مل (انظر جدول المواد) مملوءة ب 0.5 جم من مادة الطور الثابتة ل ~ 10 مجم من هضم البروتين. يجب أن تكون نسبة هضم البروتين إلى الطور الثابت حوالي 1:50 (وزن / وزن).
  2. قم بتحميل الببتيدات على العمود المحضر واغسل العمود بحوالي 10 أحجام أعمدة بنسبة 0.1٪ TFA ، متبوعة بحوالي 10 أحجام أعمدة من H2O.
  3. قم بتقطيع الببتيدات إلى ثلاثة كسور مع 10 أحجام أعمدة من محلول فورمات الأمونيوم 10 ملي مولار (الرقم الهيدروجيني = 10) بنسبة 7٪ و 13.5٪ و 50٪ أسيتونيتريل (AcN) ، على التوالي. تجميد جميع الكسور حتى الاكتمال.
  4. استخدم الأجسام المضادة لبقايا يوبيكويتين (K-ε-GG) المقترنة بخرز البروتين A agarose للتخصيب المناعي لببتيدات diGly. نظرا لأن الكمية الدقيقة للجسم المضاد لكل دفعة من الخرز هي معلومات خاصة ولا تكشف عنها الشركة المصنعة ، فمن المستحسن استخدام نفس التعريف لمجموعة من الخرز كما تفعل الشركة المصنعة لتجنب الالتباس. اغسل دفعة واحدة من هذه الخرزات 2x باستخدام PBS وقسم ملاط الخرزة إلى ستة أجزاء متساوية. انظر الشكل 1 للحصول على مخطط تجريبي مفصل.
  5. قم بإذابة كسور الببتيد الثلاثة التي تم جمعها في الخطوة 1.3 في 1.4 مل من مخزن مؤقت يتكون من 50 ملي مولار MOPS ، و 10 ملي فوسفات الصوديوم ، و 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني = 7.2) ، وقم بتدوير الحطام.
  6. أضف المواد الطافية للكسور إلى حبات الأجسام المضادة diGly واحتضانها لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية على وحدة مدورة. قم بتدوير الخرزات وانقل المادة الطافية إلى دفعة جديدة من حبات الأجسام المضادة واحتضانها مرة أخرى لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بتخزين المواد الطافية لتحليل البروتين العالمي اللاحق (GP).
  8. انقل الخرزات من كل جزء إلى طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر مزود بسدادة مرشح GF/F للاحتفاظ بالخرزات. ضع طرف الماصة مع الخرزات في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مزود بمهايئ طرف جهاز طرد مركزي. اغسل الخرزات 3x ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت IAP المثلج البارد وبعد ذلك 3x مع 200 ميكرولتر من Milli-Q H2O. قم بتدوير العمود عند 200 × جم لمدة دقيقتين قبل كل خطوة غسيل ولكن احرص على عدم ترك العمود يجف. قم بتخفيض الببتيدات باستخدام دورتين من 50 ميكرولتر من 0.15٪ TFA.
  9. قم بتحلية الببتيدات باستخدام طرف المرحلة C18 (بشكل أساسي طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر مع قرصين C18) وجففها حتى تكتمل باستخدام الطرد المركزي الفراغي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة تجريبية.(أ) نظرة عامة على النهج التجريبي. تم تحضير العينات ، والتربسين ، وتقسيمها إلى ثلاثة أجزاء باستخدام كروماتوغرافيا الطور العكسي مع شطف عالي من الأس الهيدروجيني. تم تقسيم دفعة واحدة من حبات الأجسام المضادة للببتيد التجارية α-diGly إلى ستة أجزاء متساوية ثم تم تحميل كسور الببتيد الثلاثة على ثلاثة من كسور الخرزة. تم تنقية ببتيدات diGly المناعية ، وإزالتها ، وجمعها ، وتم نقل التدفق لاحقا إلى كسور الخرز الطازجة الثلاثة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ليسيل إندوببتيداز (LysC) واكو بيور كيماويات هاتف: 129-02541 فرن NanoLC تصميم MPI ، MS Wil GmbH ملح الصوديوم N-Lauroylsarcosine سيجما ألدريتش L-5125 أوربيتراب فيوجن لوموس كتلة
مطياف ثيرموفيشر PLRP-S (300 Å ، 50 ميكرومتر) بوليمر
جزيئات الطور المعكوس تقنيات Agilent PL1412-2K01 PTMScan Ubiquitin Remnant Motif
(K-ε-GG) عده تقنيات إشارات الخلية 5562 ريال Sep-Pak tC18 6 cc خرطوشة Vac المياه WAT036790 قم بإزالة مادة tC18 من
خرطوشة قبل ملء الخرطوشة
مع PLRP-S ديوكسي كولات الصوديوم سيجما ألدريتش 30970 قاعدة تريس سيجما ألدريتش تي 6066 تريس حمض الهيدروكلوريك سيجما ألدريتش تي 5941 التربسين ، TPCK المعالج ثيرموفيشر 20233

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C18

مقالات ذات صلة