مقايسة تخليق الحمض النووي: تقنية لتقييم تخليق الحمض النووي في الخلايا المتكاثرة باستخدام دمج الثايميدين المثيل المشع

الملخص

المصدر: Williams ، M. et al. الكشف السريع عن الأنماط الظاهرية للنمو العصبي في خلايا السلائف العصبية البشرية (NPCs). J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نحدد القدرة التكاثرية للخلايا السلفية العصبية عن طريق قياس دمج التتبع المشع الثيميدين الترتيتيفي في الحمض النووي للخلايا. يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة تكاثر الخلايا بعد العلاج ببعض الأدوية وعوامل النمو.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. صيانة الشخصيات غير القابلة للعب

1. لوحة NPCs بكثافة 1.5 مليون خلية في بئر مغلف بالهلام يحاكي ECM يحتوي على 2 مل من وسائط التمدد بنسبة 100٪.
2. احتضان الشخصيات غير القابلة للعب عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. أضف 5 ميكرومتر من مثبطات ROCK إلى الوسائط لغير القابلة للعب عند P3 أو أقل ، أو لغيرها من الشخصيات المذابة ، لمنع الموت المفرط للخلايا. قم بتغيير الوسائط بعد 24 ساعة لإزالة مثبط ROCK.
4. تمر الخلايا كل 4-9 أيام ، اعتمادا على الوقت الذي تصبح فيه ملتقية. تعتبر الخلايا ملتقية عندما تصبح طبقة أحادية معبأة بكثافة تغطي الجزء السفلي من سطح الطبق بالكامل.
لوحة
5. غير قابلة للعب بكثافة من 1 إلى 1.5 مليون خلية لكل بئر واحد من صفيحة 6 آبار. قم بإزالة الوسائط المستهلكة كل 48 ساعة واستبدلها ب 2 مل من وسائط التوسعة بنسبة 100٪.

< p class = "jove_title" >3. فحص تخليق الحمض النووي للخلية السلائف العصبية

1. لوحة 100,000 خلية / بئر في صفيحة 24 بئرا وتقييمها في ثلاث نسخ / حالة.
2. أضف الثايميدين المشع ، المثلث [³H] إلى وسط المزرعة (1.5 ميكروCi / مل) في كل بئر بعد 46 ساعة في المزرعة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة < / > ملاحظه: عند استخدام المواد المشعة ، احصل على تدريب من مؤسستك ، واتبع بروتوكولات سلامة النشاط الإشعاعي ، وتخلص من المواد المشعة في أوعية النفايات المخصصة بشكل مناسب.
3. قم بإزالة الوسائط المشعة والتخلص منها بشكل صحيح بعد ساعتين. أضف 300 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA الدافئ مسبقا (0.5 مل) إلى كل بئر واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
4. قم بتشغيل حصادة الخلايا (انظر قسم المواد) والمضخة وتأكد من أن ضغط المضخة أقل من 200 رطل لكل بوصة مربعة. ضع ورق الترشيح في الفراغ الموجود في حصادة الخلايا وقم بتمزيق الزاوية اليمنى لتحديد اتجاه الورق.
5. ضع أنابيب تجميع حصادة الخلايا في صينية "فارغة" فارغة واضغط على الغسيل المسبق لترطيب ورق الترشيح. ضع أنابيب التجميع في آبار العينات وقم بتشغيلها (ابدأ).
6. عندما تنتهي حصادة الخلايا من جمع العينات ، ارفع المشبك وورق الترشيح المتقدم لتكراره لجميع مجموعات العينات. اغسل مسبقا دائما في طبق فارغ "فارغ
".
7. جفف ورق الترشيح تحت مصدر الضوء وقم بإعداد القوارير المقابلة في درج. قم بإخراج الحشائش الورقية في قوارير وأضف 2 مل من كوكتيل التلألؤ السائل إلى كل قارورة. قوارير الغطاء والملصقات.
8. احتضن القوارير في كوكتيل تلألؤ سائل لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل قراءة التعداد في الدقيقة (CPMs) على آلة التلألؤ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM / F12 متوسط متقدم ثيرموفيشر العلمي هاتف: 12634-010 مكون من وسط التمدد بنسبة 100٪ الوسط العصبي القاعدي ثيرموفيشر العلمي 21103049 أطباق 24 بئر ثيرموفيشر العلمي 2021-05 ألواح البوليسترين: تستخدم لفحص تخليق الحمض النووي NPC لامينين الفأر الطبيعي إنفيتروجين 23017-015 الركيزة لألواح الطلاء: تستخدم لتخليق الحمض النووي NPC ، ودخول المرحلة S ، وفحوصات رقم الخلية البنسلين / الستربتومايسين ثيرموفيشر العلمي 15140122 مضاد حيوي ، مكون في وسائط التمدد 2.5٪ تربسين (10X) جيبكو 15090-046 10X حل إنزيمي 0.5 م EDTA ثيرموفيشر العلمي AM9261 يستخدم في محلول التربسين لرفع الخلايا لفحص تخليق الحمض النووي تريتييت [3H] - ثيميدين بيركين إلمر NET027E001 التريتيوم المشع ، الثايميدين فيشربراند 7 مل HDPE قارورة تلألؤ فيشربراند 03-337-1 قوارير لعد التلألؤ السائل إيكولايت (+) MP الطب الحيوي 188247501 كوكتيل التلألؤ السائل LS 6500 عداد التلألؤ السائل متعدد الأغراض بيكمان كولتر 8043-30-1194 عداد التلألؤ السائل Skatron حصادة الخلايا شبه الأوتوماتيكية الأجهزة الجزيئية وشركة Skatron Instruments، Inc. النوع 11019 حصادة الخلايا شبه الأوتوماتيكية ورق ترشيح GF / C الصف ، Whatman جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة 1822-849 ورق ترشيح الألياف الزجاجية