فحص الغلاف العصبي NPC: اختبار في المختبر لتقييم الاستجابة المهاجرة للخلايا السليفة العصبية من الغلاف العصبي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Williams، M. et al. الكشف السريع عن الأنماط الظاهرية للنمو العصبي في الخلايا السلائف العصبية البشرية (NPCs).J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو مقايسة هجرة الغلاف العصبي للخلايا السليفة العصبية - وهو اختبار في المختبر لدراسة الاستجابة المهاجرة للخلايا السليفة العصبية من الغلاف العصبي - عن طريق التحليل المجهري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحص هجرة الغلاف العصبي NPC

1. تكوين الغلاف العصبي
   1. أضف 1 مل من وسائط التمدد بنسبة 100٪ في طبق 35 مم بدون ركيزة طلاء. احتضن الأطباق لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل طلاء الشخصيات غير القابلة للعب. قم بإعداد 2-3 أطباق للتأكد من وجود ما يكفي من المجالات العصبية لمقايسة هجرة الخلايا.
      ملاحظه: يضمن عدم وجود ركيزة طلاء بقاء الشخصيات غير القابلة للعب معلقة في الوسائط ، وهو أمر ضروري لتكوين الغلاف العصبي. سوف يمنع طلاء الأطباق تكوين الغلاف العصبي.
   2. رفع الخلايا وفصلها والحبيبات. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2-5 مل من وسائط التمدد 100٪ الدافئة مسبقا. طبق 1 مليون شخصية غير قابلة للعب في كل طبق 35 مم محضر في القسم 1.1.1.
   3. احتضان الشخصيات غير القابلة للعب عند 37 درجة مئوية لمدة 48 إلى 96 ساعة للسماح لالشخصيات غير القابلة للعب بالتجمع وتشكيل المجالات العصبية. قم بتقييم حجم الكرة باستخدام مسطرة حية على مجهر تباين الطور. انتظر حتى تصل معظم الكرات إلى قطر تقريبي يبلغ 100 ميكرومتر (± 20 ميكرومتر) (الشكل 1). سوف تتشتت المجالات الأصغر تماما وتتفكك أثناء مقايسة الهجرة.
2. تحضير لوحات لفحص هجرة الغلاف العصبي
   1. قم بإذابة كميات الجل المقلدة ECM إلى 6 مل من وسائط التمدد بنسبة 30٪. بمجرد تحضير محلول هلام مقلد ECM / 30٪ من وسائط التمدد ، أضف المركبات أو عوامل النمو أو الأدوية ذات الأهمية بالتركيزات المرغوبة.
      ملاحظه: يجب زيادة تركيزات المركبات والأدوية وعوامل النمو لحساب إضافة 200 ميكرولتر من المجالات العصبية في القسم 1.3.
   2. لوحة 1 مل من الجل المقلد ECM / محلول وسائط التمدد بنسبة 30٪ (± مركبات أو عوامل نمو أو أدوية) في بئر واحد من صفيحة 6 آبار. اصنع 2-3 آبار لكل حالة تجريبية. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أطباق 35 مم. احتضان الأطباق لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية^.< / > ملاحظه: لا تستنشق حل هلام ECM المقلد / 30٪ Expansion Media لهذا الفحص. سيؤدي طلاء الكرات على هلام ECM-Mimic المستنشق إلى هجرة سريعة وزائدة.
3. طلاء المجالات العصبية
   1. اجمع المجالات العصبية المتكونة في القسم 1.1 وضعها في أنبوب مخروطي الشكل. اغسل الأطباق مقاس 35 مم ب 1 مل من 1x PBS لضمان جمع جميع المجالات العصبية. قم بتدوير المجالات العصبية المجمعة عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
   2. أعد تعليق المجالات العصبية في 1-3 مل من وسائط التمدد الدافئة مسبقا بنسبة 30٪. إذا تم جمع طبق واحد من المجالات العصبية ، يتم استخدام 1 مل من الوسائط لإعادة تعليق المجالات. إذا تم جمع طبقين ، تتم إضافة 2 مل من الوسائط لإعادة تعليق الكرات ، وما إلى ذلك. ماصة برفق واستخدم P-1000 فقط لضمان عدم كسر الكرات.
   3. لوحة 200 ميكرولتر من المجالات العصبية المعلقة في محلول هلام مقلد ECM / 30٪ تمدد مصنوع في القسم 1.2. صفائح صخرية في جميع الاتجاهات لتوزيع المجالات العصبية بالتساوي. احتضان الألواح لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   4. قم بإزالة محلول الجل المقلد ECM / 30٪ Expansion Media وقم بإصلاح الخلايا في 4٪ PFA ، واغسلها واحتفظ بها في 1x PBS + 0.05٪ أزيد الصوديوم.
4. تحليل المجالات العصبية
   1. احصل على صور للمجالات العصبية بأكملها باستخدام إعدادات تباين الطور عند 10X. تأكد من أن الكرات لا تلامس بعضها البعض. قم بقياس متوسط الترحيل باستخدام برنامج ImageJ.
   2. تتبع المحيط الخارجي للغلاف العصبي باستخدام أداة الخط اليدوي. يمكن الوصول إلى الخط اليدوي عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على أيقونة الخط "المستقيم". التتبع يدويا باستخدام الماوس.
   3. استخدم وظيفة القياس لحساب مساحة التتبع. تأكد من تحديد "المنطقة" كقراءة في نافذة "تعيين القياسات" الموجودة ضمن علامة التبويب تحليل. انظر الشكل 2 للحصول على أثر للمحيط الخارجي باللون الأزرق.
   4. تتبع كتلة الخلية الداخلية للكرة وقياس المساحة. انظر الشكل 2 للحصول على أثر للمحيط الداخلي باللون الأحمر. حدد متوسط الهجرة عن طريق طرح كتلة الخلية الداخلية من إجمالي مساحة الغلاف العصبي.
   5. قم بقياس المجالات العصبية التي تظهر كتلة خلية داخلية كثيفة مع خلايا تهاجر كسجادة متجاورة (الشكل 2).
   6. لا تقم بتضمين الخلايا خارج السجادة أو المنفصلة عن الغلاف العصبي للقياس. انظر الشكل 2 للحصول على أمثلة للخلايا (المحاطة بدائرة باللون الأبيض) المستبعدة من قياس السجادة الخارجية. تحليل ما لا يقل عن 20 مجالا عصبيا لكل حالة.

النتائج

الشكل 1: اختيار المجالات العصبية لمقايسة الهجرة. (أ) صورة تباين الطور لمجال تمثيلي للمجالات العصبية في 24 ساعة. جميع الكرات أقل من 100 ميكرومتر ، وبالتالي لا يتم جمعها لمقايسة الهجرة. (ب) صورة تباين الطور لمجال تمثيلي للمجالات العصبية عند 72 ساعة. تقع جميع المجالات ضمن نطاق 100 ميكرومتر ± 20 ميكرومتر ، مما يشير إلى أنها جاهزة للتجميع لمقايسة الهجرة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الوسط العصبي القاعدي ثيرموفيشر العلمي 21103049 مكون من كل من NIM ووسيط التمدد بنسبة 100٪ وسيط الحث العصبي PSC: رابط البروتوكول: https://goo.gl/ euub7a ثيرموفيشر العلمي A1647801 هذه مجموعة تتكون من وسيط Neurobasal (NB) ومكملات تحريض عصبي 50x (NIS). يستخدم NIS لصنع وسيط الحث العصبي 1X ووسط تمدد 100٪ DMEM / F12 متوسط متقدم ثيرموفيشر العلمي هاتف: 12634-010 مكون من وسط التمدد بنسبة 100٪ Matrigel المؤهل من hESC كورنينج 354277 جل تصفية خارج الخلية مؤهل من hESC (جل مقلد ECM) 6 أطباق جيدة كورنينج كور-3506 ألواح البوليسترين المستخدمة لصيانة NPC وفحص هجرة الغلاف العصبي FGF-2 الأساسي البشري بيبروتك 100-18 ب عامل النمو البنسلين / الستربتومايسين ثيرموفيشر العلمي 15140122 مضاد حيوي ، مكون من NIM ، 100٪ توسع و 30٪ وسائط تمدد