عزل الخلايا النجمية: طريقة للحصول على تحضير نقي للخلايا النجمية القشرية للفأر

الملخص

المصدر: Schildge، S. et al. عزل وثقافة الخلايا النجمية القشرية للفأر. J. Vis. Exp. (2013)

في هذا الفيديو ، نصف طريقة الحصول على تحضير نقي للخلايا النجمية من الفئران المولودة حديثا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل وطلاء الخلايا القشرية المختلطة

< p class = "jove_content" > يمكن إجراء عزل الخلايا القشرية المختلطة لمزارع الخلايا النجمية باستخدام صغار الفئران P1 إلى P4. من أجل تحقيق كثافة الخلايا النجمية المناسبة ، من الضروري استخدام 4 قشور جرو فأر لكل قارورة لزراعة الأنسجة T75. لذلك ، يتم حساب الأحجام في البروتوكول التالي لإعداد الخلية باستخدام 4 صغار فأر.

1. قبل البدء في إجراء التشريح ، قم بتسخين 30 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية (DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز + 10٪ مصل بقري جنين معطل بالحرارة + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ؛ انظر الجدول) إلى 37 درجة مئوية. قم بتغطية قارورة T75 واحدة ب 20 مل من بولي د-ليسين (PDL) بتركيز 50 ميكروغرام / مل في ماء بدرجة زراعة الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂.
2. لإجراء التشريح ، قم بإعداد جميع الكواشف والمواد اللازمة. ستحتاج إلى مقص جراحي ، ملقط ناعم ، ملقط مسطح ، مناشف ورقية ، كيس نفايات ، 70٪ إيثانول ، و 2 طبق تشريح (قطر 3.5 سم) على ثلج مملوء ب 2 مل HBSS لكل منهما.
3. أمسك برفق رأس وعنق جرو الفأر ورشهما بنسبة 70٪ إيثانول. يتم التضحية بالحيوان عن طريق قطع الرأس باستخدام المقص.
4. قم بإجراء شق خط الوسط ، من الخلف إلى الأمام ، على طول فروة الرأس للكشف عن الجمجمة.
5. قطع الجمجمة بعناية من الرقبة إلى الأنف. يتم إجراء قطعتين إضافيتين للسماح بمزيد من الوصول إلى الدماغ: يتم إجراء القطع الأول في مقدمة البصيلات الشمية ، والآخر أدنى من المخيخ لفصل الجمجمة عن قاعدة الجمجمة.
6. باستخدام ملقط الطرف المسطح ، يتم قلب اللوحات القحفية برفق إلى الجانب ويتم إخراج الدماغ ووضعه في طبق التشريح الأول المليء ب HBSS. ضع الطبق مرة أخرى على الثلج واستمر في حصاد الأدمغة الأربعة.
7. يتم تنفيذ ما تبقى من إجراء التشريح تحت مجهر مجسم. أولا ، تتم إزالة البصيلات الشمية والمخيخ باستخدام ملقط التشريح الدقيق (الشكل 1 ب).
8. من أجل استرداد القشرة ، أمسك الطرف الخلفي للدماغ بالملقط الدقيق ، وقم بإجراء شق خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية ، وأدخل مجموعة ثانية من الملقط في البستان الذي تم إنشاؤه وقم بإزالة الهيكل الشبيه بالصفيحة للقشرة من الدماغ.
قم
9. بتشريح السحايا بعناية من نصفي القشرة المخية عن طريق السحب بالملقط الدقيق (الشكل 1 د). تتجنب هذه الخطوة تلوث ثقافة الخلايا النجمية النهائية بالخلايا السحائية والخلايا الليفية. انقل نصفي القشرة المخية المحضرين إلى الطبق الثاني المليء ب HBSS وأعده إلى الثلج. استمر وفقا لذلك مع جميع القشرة الأربعة.
10. أخيرا ، قم بتقطيع كل نصف كرة من القشرة إلى قطع صغيرة باستخدام شفرات حادة (حوالي 4 إلى 8 مرات).
11. في ظل ظروف معقمة، قم بنقل قطع القشرة إلى أنبوب فالكون واحد سعة 50 مل وأضف HBSS إلى الحجم الإجمالي البالغ 22.5 مل.
12. أضف 2.5 مل من 2.5٪ تريبسين ، واخلط واحتضان الأنسجة في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
13. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم لقطع أنسجة قشرة الحبيبات.
14. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الصرف. لتجنب فقدان حبيبات الأنسجة ، يمكنك الاحتفاظ بها ميكانيكيا باستخدام ماصة. قم بفصل الأنسجة إلى معلق خلية واحدة عن طريق إضافة 10 مل من وسط طلاء الخلايا النجمية وسحب العينات القوي باستخدام ماصة بلاستيكية سعة 10 مل حتى يتم فصل قطع الأنسجة إلى خلايا مفردة (20 إلى 30 مرة). اضبط مستوى الصوت على 20 مل باستخدام وسط طلاء الخلايا النجمية. يمكنك إثبات تفكك أنسجة القشرة إلى خلايا مفردة عن طريق العد باستخدام مقياس الدم. يجب أن ينتج عن تحضير واحد من 4 قشريات جرو فأر 10-15 ×^{10 6} خلايا مفردة منفصلة.
15. قم بشفط PDL من قارورة ثقافة T75 ، وقم بلوحة تعليق الخلية المفردة المنفصلة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂.

< p class = "jove_title" >2. الحصول على ثقافة الخلايا النجمية المخصبة

1. قم بتغيير الوسط بعد يومين من طلاء الخلايا القشرية المختلطة وجميع الأيام الثلاثة بعد ذلك.
2. بعد 7 إلى 8 أيام ، عندما تتلاقى الخلايا النجمية وتراكب الخلايا الدبقية الصغيرة مكشوفة على طبقة الخلايا النجمية أو تكون منفصلة بالفعل عن طبقة الخلايا النجمية (الشكل 2) ، قم بهز قارورة T75 عند 180 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة على شاكر مداري لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة. تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة أو إذا كنت ترغب في استزراع الخلايا الدبقية الصغيرة وفحصها ، فقم بتدويرها لأسفل وطبقها للثقافة.
3. أضف 20 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية الطازجة واستمر في هز القارورة عند 240 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات لإزالة الخلايا السلائف قليلة التغصن (OPC). نظرا لأن بعض OPCs لن تنفصل تماما عن طبقة الخلايا النجمية ، استمر في الاهتزاز بقوة يدويا لمدة 1 دقيقة من أجل منع تلوث OPC. تخلص من المادة الطافية أو قم بتدويرها لأسفل وطبقها ، إذا كنت ترغب في زراعة OPCs.
4. اشطف طبقة الخلايا النجمية المتبقية مرتين باستخدام PBS ، واستنشق PBS ، وأضف 5 مل من التربسين-EDTA واحتضانها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية. تحقق من انفصال الخلايا النجمية كل 5 دقائق وفرض انفصال الخلايا النجمية عن طريق ضرب القارورة على راحة يدك (2-3 مرات).
5. بعد فصل الخلايا النجمية عن قارورة الاستزراع ، أضف 5 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية ، وقم بتدوير الخلايا عند 180 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشق المطاف وأضف 40 مل من وسط طلاء الخلايا النجمية الطازجة. يجب أن تنتج قارورة زراعة الأنسجة T75 حوالي 1 × 10⁶ خلايا بعد انقسام الخلية الأولى. خلايا الصفائح في قوارير ثقافة T75 وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂. قم بتغيير الوسيط كل 2 إلى 3 أيام.
6. بعد 12-14 يوما من الانقسام الأول ، يتم طلاء الخلايا النجمية بتركيز الخلية المناسب قبل 24-48 ساعة من إجراء التجربة. يجب أن تنتج قارورة زراعة الأنسجة T75 حوالي 1.5-2 × 10⁶ خلايا بعد انقسام الخلية الثانية.

النتائج

الشكل 1. تشريح قشرة الفأر بعد الولادة (P3). أ) الدماغ كله. ب) الدماغ بعد إزالة البصيلات الشمية والمخيخ. ج) عزل القشرة عن طريق تقشير البنية الشبيهة بالصفيحة للقشرة من الدماغ. د ، د') القشرة من الموقع البطني والظهري مع السحايا (تشير الأسهم السوداء إلى الشرايين السحائية). ه) القشرة بدون السحايا. شريط المقياس ، 1.5 مم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وسائط ثقافة الخلايا النجمية نسبة عالية من الجلوكوز DMEM تقنيات الحياة 31966-021 FBS معطل بالحرارة تقنيات الحياة 10082-147 التركيز النهائي: 10٪ البنسلين - ستربتومايسين تقنيات الحياة 15140-122 التركيز النهائي: 1٪ حل لهضم أنسجة المخ HBSS تقنيات الحياة 14170-088 2.5٪ تريبسين تقنيات الحياة 15090-046 التركيز النهائي: 0.25٪ آخر 70٪ (vol / vol) الإيثانول روث 9065.2 بولي د-يسين ميليبور A-003 أ -003 ه الماء جمعية المحاسبين الفلسطينيين S15-012 درجة زراعة الخلية برنامج تلفزيوني جمعية المحاسبين الفلسطينيين H15-002 درجة زراعة الخلية 0.05٪ تريبسين EDTA تقنيات الحياة هاتف: 25300-062 0.45 ميكرومتر مرشح معقم سارتوريوس 16555 [إ] طبق بتري 3.5 سم بي دي فالكون 353001 15 مل أنبوب فالكون بي دي فالكون 352096 50 مل أنبوب فالكون بي دي فالكون 352070 75 سم 2 قارورة زراعة الأنسجة بي دي فالكون 353136 ملقط غرامة دومونت 2-1032; 2-1033 #3c; # 5 ملقط طرف مسطح KLS مارتن 12-120-11 مقص جراحي 13 سم أسكولاب بي سي -140-ر مجهر مجسمة لايكا ميتز7.5 مجهر مجسمة + كاميرا لايكا MZ16F ؛ DFC320 مجهر + كاميرا زييس; كانون بريمو فيرت. كاميرا PowerShot A650 IS الطرد المركزي إيبندورف 5805000.017 جهاز طرد مركزي5804R شاكر مداري الترمو: العلمية SHKE 4450-1CE ماكس كيو 4450 حمام مائي جولابو [سوب20]; 37 [ك]