زراعة الخلايا البطانية من الأوعية الدقيقة لدماغ الفئران: إجراء لعزل وزراعة الخلايا البطانية من الأوعية الدقيقة لدماغ الفئران

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Molino، Y. et al. إعداد نموذج في المختبر للحاجز الدموي الدماغي للفئران (BBB): التركيز على نفاذية BBB والنقل بوساطة المستقبلات. J. Vis. Exp.(2014)

يعرض هذا الفيديو عزل الأوعية الدقيقة عن دماغ الفئران باستخدام مزيج من الطرد المركزي المتدرج للكثافة وأجهزة الهضم الأنزيمية. يمكن زراعة الأوعية الدقيقة المعزولة في قارورة مزرعة مغلفة مسبقا بمصفوفة الكولاجين والفيبرونيكتين للحصول على مستعمرات الخلايا البطانية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل الأوعية الدقيقة لدماغ الفئران

1. لكل مستحضر ولمجرب واحد ، استخدم 3 فئران ويستار عمرها خمسة أسابيع.
2. يوم الاثنين من الأسبوع الأول ، قم بإعداد 2 قارورة T75 عن طريق الطلاء بالكولاجين من النوع الرابع والفيبرونكتين ، وكلاهما بمعدل 1 ميكروغرام / سم² في ماء مزرعة معقم (10 مل لكل T75). اتركيه يلتصق عند 37 درجة مئوية حتى بذر الأوعية الدقيقة.
3. صباح الأربعاء من الأسبوع الأول ، قم بالقتل الرحيم للفئران تحت تدفق متزايد من ثاني أكسيد الكربون₂ للحث على النعاس وفقدان الموقف وانقطاع التنفس ، ثم يتبعه خلع عنق الرحم. رش الرؤوس بنسبة 70٪ من الإيثانول. قطع الرؤوس بزوج من المقص ونقلها إلى طبق بتري جاف تحت غطاء تدفق رقائقي.
4. قم بإزالة الأدمغة من الجمجمة بدون المخيخ والأعصاب البصرية ، ثم انقلها إلى طبق بتري مبرد على الجليد ومملوء بمحلول التسلخ البارد (HBSS مكمل بنسبة 1٪ BSA ، والبنسلين 100 وحدة / مل ، والستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل).
5. قطع الأدمغة إلى نصفين لفصل نصفي الكرة المخية وفصل الدماغ المتوسط عن الدماغ الأمامي. انقل الدماغ الأمامي إلى طبق بتري نظيف على الثلج مع محلول تشريح.
6. خذ نصفي الكرة الأرضية في طبق بتري جديد مع عازلة تشريح بارد لإزالة السحايا بعناية من الدماغ الأمامي تحت مجهر مجسم باستخدام ملقط منحني N ° 5. ثم قم بتنظيف الجزء الداخلي من الدماغ لإزالة لحاف المايلين والحصول على قشرة من القشرة. يجب ألا تستغرق هذه الخطوات أكثر من ساعتين للحفاظ على الأنسجة وبقاء الخلايا.
7. قم بفصل القشرة من 3 أدمغة إلى 6 مل من المخزن المؤقت للتسلخ البارد في الخالط 7 مل بواسطة 10 ضربات لأعلى ولأسفل مع كل من مدقات من خلوصات مختلفة ، 71 ميكرومتر متبوعة ب 20 ميكرومتر.
8. قسم المعلق للحصول على ما يعادل قشرة واحدة في 1 مل من أنبوب فالكون سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
9. هضم المعلق من قشرة واحدة مع 1 مل من محلول إنزيمي يحتوي على مزيج من الكولاجيناز / التباين (60 ميكروغرام / مل - 0.3 وحدة / مل) ، نوع DNase الأول (35 ميكروغرام / مل - 20 كلفن وحدة / مل) ، والجنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) في شاكر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
10. امزج هضم 1 مل من قشرة واحدة مع 10 مل من 25٪ BSA / HBSS 1X وافصلها عن طريق الطرد المركزي المعتمد على الكثافة عند 3,600 × جم لمدة 15 دقيقة في RT. انقل القرص العلوي بعناية (المايلين وحمة الدماغ) والمادة الطافية إلى أنبوب فالكون نظيف سعة 50 مل وكرر الطرد المركزي. احتفظ بالحبيبات الناتجة التي تحتوي على الأوعية الدقيقة للدماغ عند 4 درجات مئوية.
تخلص
11. بعناية من القرص العلوي والمادة الطافية. أعد تعليق كل من الكريات الناتجة التي تحتوي على الأوعية الدقيقة في الدماغ مع 1 مل من HBSS 1X البارد ونقلها إلى أنبوب فالكون نظيف سعة 50 مل.
12. اغسل الأوعية الدقيقة بإضافة 20 مل من HBSS 1X البارد وجهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق.
13. علاوة على ذلك ، قم بهضم الأوعية الدقيقة من قشرة واحدة مع 1 مل من نفس المحلول الأنزيمي كما هو موضح في الخطوة 1.9 خلال ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في شاكر.
14. بعد ذلك ، قم بخلط الأوعية الدقيقة المهضومة من كل من القشرة الثلاثة في أنبوب واحد وافصلها أيضا إلى أنبوبين من Falcon سعة 50 مل للحصول على أوعية دقيقة مستخرجة من ما يعادل قشرة واحدة ونصف (1.5) لكل أنبوب. أضف 30 مل من محلول التشريح البارد وجهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق عند RT.
15. أعد تعليق حبيبات الأوعية الدقيقة في 10 مل من DMEM / F12 مكملا بنسبة 20٪ من مصل البلازما البقري المفتقر إلى الصفائح الدموية ، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF ، 2 نانوغرام / مل) ، والهيبارين (100 ميكروغرام / مل) ، والجنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) و HEPES (2.5 مل) ، المسمى وسط الخلايا البطانية (ECM) المكمل بالبورومايسين عند 4 ميكروغرام / مل.
16. خذ قوارير T75 المطلية من الحاضنة ، واستنشق فائض الطلاء ، وقم بطلاء الأوعية الدقيقة من كل أنبوب في قارورة T75 واحدة (أوعية دقيقة مستخرجة من 1.5 قشرة لكل قارورة T75).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصل الأبقار الجنينية إنفيتروجين 10270-098 -20 درجة مئوية / 1 سنة BSA الكسر V السموم الداخلية المنخفضة جمعية المحاسبين الفلسطينيين ك 45-011-500 جرام 4 درجة مئوية البنسلين - ستربتومايسين إنفيتروجين 15140-122 -20 درجة مئوية قوارير T75 بيكتون ديكنسون فالكون 353135 عازلة HEPES (1 متر) إنفيتروجين هاتف: 15630-056 4 درجات مئوية / 1 سنة فأر الكولاجين من النوع الرابع (10 × 1 مجم) بيكتون ديكنسون 356233 -20 درجة مئوية / 1 شهر بلازما فيبرونيكتين (5 مجم) بيكتون ديكنسون 356008 -20 درجة مئوية / 1 شهر مقص زنبركي فاناس ، مستقيم (9 سم) أدوات العلوم الدقيقة 91500-09 مقص مستقيم (9 سم) أدوات العلوم الدقيقة 14568-09 ملقط دومون # 5/45 (11 سم) أدوات العلوم الدقيقة 11251-35 ملقط Graefe ، عرض الطرف 0.8 مم أدوات العلوم الدقيقة 11050-10 ملقط Graefe ، عرض طرف المنحنى 0.8 مم أدوات العلوم الدقيقة 11051-10 مزيج الكولاجيناز / التباين (2 × 5 مجم) تشخيص روش 05 401 054 001 -20 درجة مئوية / 3 أشهر DNase I (100 مجم / 569 كيلو و / مجم) سيجما ألدريتش DN25-100 مجم -20 درجة مئوية / 1 سنة جنتاميسين (10 مجم / مل) إنفيتروجين 15710-049 4 درجات مئوية / 1 سنة DMEM / F12 إنفيتروجين 31331-028 4 درجة مئوية مصل البقر من البلازما الفقيرة للصفائح الدموية (500 مل) كلينيساينس بي تي -214-100 -20 درجة مئوية / 1 سنة bFGF (10 ميكروغرام) إنفيتروجين 13256-029 -20 درجة مئوية / 6 أشهر ملح الهيبارين Na من الغشاء المخاطي للخنازير الصف الأول سيجما ألدريتش H3149-100KU 4 درجات مئوية / 1 سنة بوروميسين سيجما ألدريتش P8833-10 ملغ -20 درجة مئوية / 6 أشهر