حاجز الورم الدموي في الدماغ أو نموذج BBTB: تكيف الحاجز الدموي الدماغي أو نموذج BBB لتقييم توصيل العلاجات للورم

الملخص

المصدر: Le Joncour، V. et al. التنبؤ بتسليم الحمولات في الجسم الحي باستخدام حاجز ورم الدم الدماغي في طبق.

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا شاملا لإنشاء نموذج في المختبر يحاكي حاجز الورم الدموي في الدماغ. يبشر النموذج بفهم تقديم العوامل العلاجية لعلاج أورام الدماغ.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. إنشاء BBTB Mimics

ملاحظة: تم تفصيل وسط زراعة الخلايا والمكملات الغذائية في جدول المواد.

1. تحضير الخلايا النجمية
   ملاحظه: المجلدات التالية مناسبة لطبق بتري مقاس 10 سم أو قارورة ثقافة خلية T75.
   1. تحت غطاء زراعة الخلايا المعقم ، اغسل الخلايا النجمية المستزرعة بعناية باستخدام 5 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS). تخلص من PBS برفق باستخدام مضخة تفريغ وأضف 2 مل من كاشف تفكك الخلية لمدة 5 دقائق (عند 37 درجة مئوية ، انظر جدول المواد) لفصل الخلايا. تحقق من انفصال الخلية تحت المجهر. لا تتجاوز 5 دقائق من الحضانة للحد من الضغط على الخلايا.
   2. أضف 10 مل من وسط زراعة الخلايا النجمية الكامل المعقم (ABM +) إلى الوعاء لتثبيط نشاط كاشف تفكك الخلية. استخدم ماصة مصلية معقمة لنقل الخلايا المنفصلة من الوعاء إلى أنبوب معقم سعة 15 مل. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 3 دقائق عند 250 RCF (التسارع: 9 RCF / s ، التباطؤ: 5 RCF / ثانية) في درجة حرارة الغرفة (RT).
   3. في هذه الأثناء ، قم بإعداد الإدخالات (انظر جدول المواد): باستخدام ملقط معقم ، ضع الإدخالات مع وضع جانب الدماغ لأعلى (الشكل 1 أ) على غطاء صفيحة معقمة مكونة من 6 آبار (الشكل 1 ب). تحقق مسبقا من إمكانية وضع اللوحة رأسا على عقب على الإدخالات دون لمس أو تحريك الإدخالات أثناء العملية.
      ملاحظة: يسمح الوضع الصحيح للإدخالات بمحاصرة تعليق الخلايا النجمية بين الغشاء وقاع البئر.
   4. بمجرد الطرد المركزي ، تخلص بعناية من المادة الطافية من تعليق الخلية ؛ أعد تعليق حبيبات الخلايا النجمية في 1 مل من ABM + عن طريق إعادة تعليق الحبيبات برفق على جدار الأنبوب حتى 5x. تجنب سحب العينة المفرط للخلايا للحد من الضغط على الخلايا. عد الخلايا واضبط كثافة تعليق الخلية إلى 1.5 × 10⁵ خلايا في 400 ميكرولتر من ABM + / إدراج.
   5. ضع معلق الخلية في منتصف جانب الدماغ من غشاء الملحق (الشكل 1 ب) ، وقم بنشره بحذر شديد باستخدام قوة الشعيرات الدموية بطرف ماصة معقمة. تجنب الاتصال المباشر لأن الغشاء هش بشكل خاص.
   6. مع استمرار جانب الدماغ من الإدخالات ، ضع اللوحة المكونة من 6 آبار مرة أخرى على الإدخالات. هذا يضمن أن تعليق الخلية محاصر بين الغشاء والقاع الفعلي للبئر (الشكل 1 ج). تجنب فقاعات الهواء في تعليق الخلية ، لأنها ستمنع الانتشار المتجانس للخلايا النجمية على الغشاء.
   7. ضع اللوحة والإدخالات ، مع وضع جانب الدماغ لأعلى ، في الحاضنة (عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) للسماح للخلية بالالتصاق لمدة لا تقل عن ساعتين (الخلايا النجمية الخالدة في الفئران) وما يصل إلى 6 ساعات (الخلايا النجمية الأولية البشرية).
      ملاحظة: نظرا للحفاظ على الإدخالات رأسا على عقب ، لا يمكن تصور التصاق الخلية تحت المجهر. لذلك ، يوصى بزرع وعاء منفصل لزراعة الخلايا العادية والتحكم في التصاق الخلية في الوعاء بمرور الوقت. يعد التلاعب الدقيق بالغشاء أمرا ضروريا لأن النتائج لن تكون موثوقة عند تلف الأغشية.
   8. في نهاية وقت الحضانة ، تحقق من عدم وجود تسرب لتعليق الخلية خارج منطقة البذر وتخلص من الإدخالات إذا كانت متسربة. أعد اللوحة المكونة من 6 آبار إلى موضعها المعتاد ، مع إدخالات ستجعل جانب الدم الآن لأعلى (الشكل 1 أ). أضف 2.6 مل من ABM + إلى كل بئر. صب 2.5 مل من وسط الخلايا النجمية الكامل في كل ملحق وضع اللوحة في الحاضنة (عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).

< p class = "jove_title" >2. تحضير الخلايا البطانية

ملاحظة: بالنسبة للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في دماغ الفئران (bEND3) ، يجب أن تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 100٪ لضمان ملامسة الخلايا القصوى التي تؤدي إلى التعبير الأمثل لبروتين التوصيل الضيق في يوم التجربة. هذا لا ينطبق على الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HuAR2T) حيث أن وجود الخلايا النجمية مطلوب لتعبير بروتين التوصيل الضيق لهذه الخلايا.

1. تابع كما هو موضح سابقا للخلايا النجمية لتفكك الخلايا. بمجرد الطرد المركزي ، تخلص بعناية من المادة الطافية ؛ أعد تعليق حبيبات الخلية البطانية في 1 مل من وسط زراعة الخلايا البطانية الكامل (EBM +) عن طريق سحب تعليق الخلية ببطء على جدار الأنبوب حتى 5x. تجنب سحب العينة المفرط للخلايا للحد من الضغط على الخلايا. عد الخلايا واضبط كثافة تعليق الخلية إلى 2 × 10⁵ خلايا في 2.5 مل / إدراج وسط زراعة الخلايا البطانية الخالي من المصل (EBM-) وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية - A (VEGF-A).
2. أخرج اللوحة التي تحتوي على الإدخالات ، وتخلص من الوسط بعناية من جانب الدم ، واستبدله ب 2.5 مل من تعليق الخلية البطانية. أعد اللوحة إلى الحاضنة (عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) واتركها طوال الليل حتى تلتصق الخلايا البطانية بالغشاء.
3. في اليوم التالي ، قم بإعداد صفيحة معقمة مكونة من 6 آبار عن طريق نقل 3 مل من وسط الخلايا النجمية الخالية من المصل (ABM-) إلى كل بئر. من خلال التعامل مع الإدخالات باستخدام ملقط معقم ، تخلص بعناية من الوسط البطاني الكامل من جانب الدم ، ضع الملحق في اللوحة الجديدة التي تحتوي على ABM- ، وأضف 2.5 مل من EBM-.
   ملاحظه: استخدام EBM- أمر بالغ الأهمية لإنشاء الحاجز البطاني.
4. اترك الإدخالات في الحاضنة (عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) مع الحد الأدنى من الاضطرابات الجسدية والتغيرات في درجات الحرارة لمدة 5 أيام ، مما يسمح بإنتاج الغشاء القاعدي البطاني ، وملامسات الخلايا النجمية للخلايا البطانية ، وفي النهاية ، تكوين BBTB المقلد. استبدل الوسيط في يوم النقل على مزارع خلايا الورم الدبقي.

< p class = "jove_title" >3. تحضير خلايا الورم الدبقي

ملاحظة: على الرغم من استخدام مجالات الورم الأرومي الدبقي المشتق من المريض هنا ، إلا أنه يمكن تكييف البروتوكول التالي بسهولة لخلايا الورم الأرومي الدبقي الملتصقة والمتوفرة تجاريا مثل U-87MG.

1. اختياريا ، للتصوير المناعي ، ضع ما يصل إلى أربعة أغطية مستديرة معقمة من البورسليكات (ø 0.9 سم) لكل بئر في صفيحة من 6 آبار تحتوي على 2 مل من بولي دي ليسين (0.01٪). احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
2. وفي الوقت نفسه ، انقل كرات الورم بعناية من وعاء زراعة الخلايا إلى أنبوب معقم سعة 15 مل باستخدام ماصة مصلية معقمة. الطرد المركزي لكرات الورم لمدة 3 دقائق عند 250 RCF.
3. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الكرات برفق في 1 مل من وسط خلية الورم الدبقي الخالي من bFGF / EGF (GBM-) وعد الخلايا. اضبط كثافة الخلية على حوالي 10⁴ كرات / مل (10⁵ خلايا / مل) في GBM-.
4. تخلص من poly-D-lysine من الآبار واشطفها 3x باستخدام PBS المعقم. قم بزرع اللوحة ب 3 مل / بئر من التعليق الكروي للورم وانقل الإدخالات باستخدام تقليد BBB على تعليق الخلية السرطانية.
5. احتضان طوال الليل (عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) للسماح بالتوازن بين جانبي الدم ورم المخ في الفحص. في اليوم التالي ، استبدل الوسائط الموجودة في جانب الدم ب EBM - المكملة بالجزيئات / الأدوية / الجسيمات النانوية ذات الأهمية. يتم جمع العينات بمرور الوقت للقياس الكمي المباشر كما هو موضح في القسم السابق. يتم تثبيت الخلايا في نقطة زمنية محددة للتصوير الفلوري.

النتائج

الشكل 1: وصف نموذج حاجز الورم الدموي في الدماغ (BBTB).(أ) التمثيل التخطيطي لمواقع أنواع الخلايا المختلفة. (ب) رسم توضيحي لموضع الإدخال على غطاء اللوحة المكون من 6 آبار وتقنية البذر للخلايا النجمية على جانب الدماغ من غشاء الإدخال. (ج) رسم توضيحي لوضع الصفيحة المكونة من 6 آبار مما يسمح بالتصاق الخلايا النجمية. (د) صور مجهرية مناعية لبروتينات التوصيل الضيقة zonula occludens...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلايا باند3 ATCC علامة الإقليم - 2299 مستنبت: DMEM (1 جم / لتر جلوكوز) مكمل بنسبة 10٪ FBS - 5 مل من L-glutamine و 5 مل بنسلين / ستربتومايسين الخلايا النجمية الخلدة للفأر HIFko معزولة في مختبر الدكتور غابرييل بيرجرز https://doi.org/10.1016/ S1535-6108 (03) 00194-6 مستنبت: BME-1 مكمل ب 5٪ FBS- 5 مل 1 M HEPES-5 مل 100 ملي بيروفات الصوديوم - 3 جم D-glucose و 5 مل بنسلين / ستربتومايسين هوAR2T معزول في مختبر الدكتور داغمار ويرث https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 مستنبتة في: EBM-2 مع مكملخلط الخلايا النجمية الأولية البشرية الطبيعية Lonza CC-2565 مستنبتة في: ABM مع SingleQuots المواد والكواشف 100 مم × 17 مم طبق Nunclon Delta ثيرموفيشر العلمي هاتف 150350 10 مل ماصة مصلية ثيرموفيشر العلمي 170361 15 مل أنابيب الطرد المركزي المعقمة المخروطية من مادة البولي بروبيلين ثيرموفيشر العلمي 339650 ABM بازال متوسط 500 مل لونزا سي سي -3187 للخلايا النجمية البشرية الأولية. ABM+: يحتوي على جميع الإضافات من مزيج المكملات الغذائية. ABM-: جميع المواد المضافة باستثناء rhEGF و FBS محلول انفصال خلية Accutase كورنينج 25-058-CI AGM SingleQuots المكملات الغذائية وعوامل النمو لونزا CC-4123 مكمل B27 جيبكو 17504-044 لكل من GBM + و - متوسط النسر القاعدي المتوسط ثيرموفيشر العلمي 21010046 BME-1 لوحات Corning Costar TC المعالجة ب 6 آبار سيجما ألدريتش CLS3506 إدراج ثقافة خلايا غشاء البوليستر Corning Transwell سيجما ألدريتش CLS3452 د-الجلوكوز سيجما ألدريتش G8270 يذوب في 50 مل من BME-1 والفلتر المعقم قبل إضافته إلى الوسط Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient F-12 Ham جيبكو هاتف: 21331-020 خاص بثقافة المجالات المشتقة من المريض المعزولة في مختبرنا ؛ قد تختلف باختلاف خطوط خلايا الورم الدبقي الأخرى مكمل النمو EBM-2 المتوسطمزيج PromoCell ج -39216 EBM +: يحتوي على جميع الإضافات من مزيج المكملات الغذائية. EBM-: جميع المواد المضافة باستثناء VEGF-A و FBS الوسط القاعدي البطاني 2 (EBM-2) PromoCell سي -22211 EBM +: يحتوي على جميع الإضافات من مزيج المكملات الغذائية. EBM-: جميع المواد المضافة باستثناء VEGF-A و FBS مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، مؤهل ، معطل بالحرارة ، معتمد من الاتحاد الأوروبي من أصل أمريكا الجنوبية ثيرموفيشر العلمي 10500056 ملح الصوديوم الفلورسين سيجما ألدريتش F6377 Greiner CELLSTAR 96 ألواح بئر سيجما ألدريتش غرينر 655090 آبار البوليسترين الأسود ذات قاع مسطح (مع قاع دقيق الشفاف) Menzel-Gläser 0.9 سم غطاء البورسليكات المستدير زلات الترمو: العلمية 10313573 أقراص PBS فصه 09-9400-100 قرص واحد لكل لتر من dH2O ؛ ثم تعقيم المحلول عن طريق التعقيم بولي د-ليسين هيدروبروميد سيجما ألدريتش ص 6407 EGF البشري المؤتلف بيبروتك GMP100-15 بالنسبة إلى GBM+ المتوسطة FGF البشري المؤتلف الأساسي (154 أ) بيبروتك 100-18 ب بالنسبة إلى GBM+ المتوسطة