فحص نفاذية الحاجز الدموي الدماغي المقلد: اختبار في المختبر لتقييم نفاذية BBB Copy لجزيئات التتبع

الملخص

المصدر: Le Joncour، V. et al. التنبؤ بتسليم الحمولات في الجسم الحي باستخدام حاجز ورم الدم في الدماغ في طبق.

يصف هذا الفيديو مقايسة النفاذية لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الدماغي في المختبر باستخدام جزيئات فلورسين الصوديوم.

البروتوكول

1. قياس نفاذية BBTB المحاكي
   

   يسمح
   1. الانتشار السلبي لصبغة الفلورسنت ذات الوزن الجزيئي الصغير الصوديوم والفلورسين (Na-Fl) بمرور الوقت من الدم إلى جانب الدماغ من الإدخالات بحساب قيم النفاذية وفقا للصيغة التالية:
      هنا ، dFwell هي قيمة التألق المقاسة في البئر عند نقطة زمنية معينة مطروحا منها قيمة التألق الذاتي لوسط زراعة الخلية ، dT هو الوقت بالثواني ، A هو سطح الحاجز بالسنتيمتر المربع ، و dFinsert هي قيمة التألق المقاسة في الإدخال في نفس النقطة الزمنية مطروحا منها قيمة التألق الذاتي المتوسطة).
   2. اجمع 100 ميكرولتر من الوسط من كل من جانبي الدم والدماغ من تقليد BBTB وانقل كل منهما إلى صفيحة منفصلة مسطحة القاع ذات 96 بئرا سوداء لقياسات التألق اللاحقة. استخدم الوسائط العادية كفراغ لتصحيح التألق الذاتي.
   3. تحضير 2.5 مل لكل بئر من Na-Fl (50 ميكرومتر) في EBM-. قم بتسخين محلول Na-Fl مسبقا إلى 37 درجة مئوية. استبدل الوسائط من الجانب الدموي من الإدخالات بالوسائط التي تحتوي على Na-Fl. ابدأ المؤقت بمجرد استبدال الوسيط.
   4. اجمع بعناية 100 ميكرولتر من الوسائط من كل من جانب الدم والدماغ من الإدخالات في 5 و 30 و 60 و 120 دقيقة.
   5. وفقا لذلك ، استبدل الوسائط المجمعة من الإدخالات للحفاظ على توازن الحجم بين كلا الجانبين. ضع الإدخالات مرة أخرى في الحاضنة بين كل مجموعة عينات لتقليل التغيرات في درجة الحرارة.
   6. حدد كمية التألق من العينات التي تم جمعها ، باستخدام قارئ لوحة مع ضبط المرشح على 480/560 نانومتر (الإثارة والانبعاث ، على التوالي).
      ملاحظه: لا يمكن اكتشاف التألق من جانب الدماغ تقريبا عند النقطة الزمنية البالغة 5 دقائق. تشير القيم العالية مقارنة بالفراغ إلى تسرب / تلف غشاء الإدخال أو الحاجز. لذلك ، استبعدها من التحليلات الإضافية. يجب أن تكون قيم نفاذية Na-Fl المتوقعة ل BBTB في نطاق 10-5 إلى 10-6 سم / ث (الجدول 1).

الجدول 1: قيم نفاذية فلوريسين الصوديوم (Na-Fl) (بالسنتيمتر في الثانية) المحددة في المختبر في أنظمة الزراعة المشتركة المشار إليها وفي الجسم الحي في الفئران العارية NMRI. بيانات من تجربة تمثيلية (ن = 3 فئران).

تقليد الفئران BBTB باند3 bEND3 + HIFko As bEND3 + جيجابايت bEND3 + HIFko As + جيجابايت في الجسم الحي النفاذية (10-6 سم / ثانية) 27.63 دولار 6.74 دولار 26.8 [إ] 10.83 دولار 5.57 SD (10-6 سم / ثانية) 3.45 دولار أمريكي 3.01 7.99 دولار أمريكي 2.65 دولار 2.19 دولار تقليد BBTB البشري هوAR2T HuAR2T + hIAs HuAR2T + جيجابايت HuAR2T + hIAs + جيجابايت النفاذية (10-6 سم / ثانية) 104.92 دولار 47.4 ب 89.08 دولار 48.24 [إ] SD (10-6 سم / ثانية) 27.1 [م] 14.32 [إك] 10.21 13.07

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المواد والكشف 10 مل ماصة مصلية ثيرموفيشر العلمي 170361 ABM Basal Medium، 500 مل لونزا سي سي -3187 للخلايا النجمية البشرية الأولية. ABM+: يحتوي على جميع الإضافات من مزيج المكملات الغذائية. ABM-: جميع المواد المضافة باستثناء rhEGF و FBS النسر القاعدي المتوسط ثيرموفيشر العلمي 21010046 BME-1 Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient F-12 Ham جيبكو هاتف: 21331-020 خاصة بثقافة المجالات المشتقة من المريض المعزولة في مختبرنا ، قد تختلف باختلاف خطوط خلايا الورم الدبقي الأخرى Greiner CELLSTAR 96 ألواح بئر S سيجما ألدريتش غرينر 655090 آبار البوليسترين الأسود ذات قاع مسطح (مع قاع دقيق الشفاف) ملح الصوديوم الفلورسين سيجما ألدريتش F6377 قارئ الألواح الدقيقة FLUOstar Omega بي إم جي لابتك خلايا باند3 ATCC علامة الإقليم - 2299 مستنبت: DMEM (1 جم / لتر جلوكوز) مكمل بنسبة 10٪ FBS و 5 مل L-glutamine و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين الخلايا النجمية الخلدة للفأر HIFko معزولة في مختبر الدكتور غابرييل بيرجرز https://doi.org/10.1016/ S1535-6108 (03) 00194-6 مستنبت: BME-1 مكمل بنسبة 5٪ FBS ، 5 مل 1 M HEPES ، 5 مل 100 ملي بيروفات الصوديوم ، 3 جم د-جلوكوز و 5 مل بنسلين / ستربتومايسين هوAR2T معزول في مختبر الدكتور داغمار ويرث https://doi.org/10.1089/ ten.tea.2009.0184 مستنبت: EBM-2 مع SupplementMix الخلايا النجمية الأولية البشرية الطبيعية لونزا سي سي -2565 مثقف في: ABM مع SingleQuots