تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان وتم استعراضها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
< p class = "jove_title" >
1. التجانس
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات 4 درجات مئوية.
- أضف 1.5 مل من التريكايين (15 ملم) إلى أطباق بتري 90 مم تحتوي على 50 يرقة في 50 مل من وسط الجنين E3 المعالج ب 200 ميكرومتر PTU لتخديرها بشكل نهائي.
- امتصاص 10 يرقات مخدرة من أطباق بتري باستخدام ماصة بلاستيكية سائبة سعة 3 مل من باستور.
- انقل اليرقات المخدرة 10 × 10 إلى طبق بتري مقاس 55 مم مملوء بوسط جنين E3 المثلج + Tricaine.
- تحت المجهر المجسم ، قم بمحاذاة 10 يرقات في وسط طبق بتري. بعد ذلك ، قم بتمرير رؤوس اليرقات فوق كيس الصفار باستخدام مقص دقيق جراحي (استبعاد مثانة السباحة لتجنب الرؤوس العائمة).
- امتصاص الرؤوس من أطباق بتري باستخدام ماصة بلاستيكية سائبة سعة 3 مل من باستور. انتظر حتى تتجمع جميع الرؤوس داخل طرف الماصة ثم انقلها إلى مجانس زجاجي يحتوي على 1 مل من الوسائط المثلجة A (النقل بحجم بسيط لتقليل تخفيف الوسائط A بواسطة E3 + Tricaine). احتفظ بالخالط الزجاجي على الثلج. استخدم الخالط واحدا لكل حالة تجريبية.
- استبدل كل طبق بتري صغير يحتوي على E3 + Tricaine المثلج بآخر جديد كل 30 دقيقة للتأكد من إجراء التشريح في وسط E3 + Tricaine البارد.
- استبدل الوسائط المثلجة A في الخالط الزجاجي عندما يبدأ اللون في التلاشي.
ملاحظة: الوسائط يمكن أن يؤدي التخفيف إلى تغيير أنسجة الرأس بسبب التغيرات في درجات الحرارة.
- بمجرد جمع جميع الرؤوس (600 رأس / حالة) ، قم بإزالة الحد الأقصى لحجم الوسائط A من الخالط الزجاجي واستبدله ب 1 مل من الوسائط المثلجة الطازجة A.
- قم بتعطيل أنسجة المخ باستخدام الخالط الزجاجي الضيق على الجليد. قم بإجراء 40 جولة من التكسير واللفات ل 3-5 يرقات dpf و 50 ليرقات 7 و 8 dpf.
- أضف 2 مل من الوسائط A إلى تعليق الخلية (1 مل من الوسائط A / 200 رأس) ، مما سيخفف الخلايا ويقلل من تكتلها بالمايلين لتسهيل فصلها أثناء الطرد المركزي في وسط تدرج الكثافة.
- للتخلص من تكتل الخلايا ، قم بتشغيل تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب صقر بارد سعة 50 مل محفوظ على الجليد. كرر هذه العملية 3 مرات.
- انقل 1 مل من تعليق الخلية إلى أنابيب باردة سعة 1.5 مل وقم بتدويرها عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية باستخدام حقنة 10 مل + إبرة 23 جم × 1 بوصة.
- أعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من وسط التدرج الكثيف المثلج البارد بنسبة 22٪ متراكب برفق ب 0.5 مل من DPBS المثلج البارد 1x (لا تخلطها ، سيظهر طور بيني بين كلا المحلولين).
- أنابيب الدوران عند 950 جم بدون فرامل وتسارع بطيء لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية
ملاحظة: تفصل هذه الخطوة المايلين عن الخلايا الأخرى عن طريق عزله عند الطور البيني لوسط التدرج بكثافة DPBS 1x و 22٪ ، بينما ستقوم الخلايا بالحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب. تكون إزالة المايلين أكثر كفاءة عندما لا يكون تركيز الخلية مرتفعا جدا.
- باستخدام حقنة 10 مل + إبرة 23G x 1 '' تخلص من الحد الأقصى ل DPBS ، ووسط تدرج الكثافة ، والمايلين المحاصر في الطور البيني.
- اغسل الخلايا ب 0.5 مل من الوسائط A + 2٪ من مصل الماعز العادي (NGS) ، ثم قم بتدوير الأنابيب عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من الحد الأقصى للمادة الطافية ، ثم اجمع جميع كريات الخلايا من نفس الحالة التجريبية معا في 1 مل من الوسائط A + 2٪ NGS.
- إذا كانت الخلايا ذات الأهمية تعبر عن بلاعم / خلايا دبقية شبيهة بالبروتين الفلوري من mpeg1: eGFP أو الخلايا العصبية من NBT: DsRed ، فقم بتشغيل تعليق الخلية من خلال غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر وانقلها إلى أنابيب FACS باردة سعة 5 مل على الجليد ، محمية من الضوء><.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تلطيخ مناعي للخلايا الدبقية الصغيرة.