$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة < ص = "jove_title" >
1. تلطخ المناعة الدبقية الصغيرة
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق حبيبات الخلية التي تم الحصول عليها من خلايا زراعة الدماغ مع 0.3 مل من الوسائط A + 2٪ مصل الماعز العادي أو NGS. قم بتقسيمها إلى أنابيب 3 × 1.5 مل: واحدة للخلايا غير الملوثة لقياس التألق الذاتي من الخلايا ذات الأهمية ، والثانية للجسم المضاد الثانوي (1/200) لقياس الارتباط غير المحدد للجسم المضاد الثانوي بالخلايا الدبقية الصغيرة ، والثالث كاختبار (الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر 4C4 (خاص بالخلايا الدبقية الصغيرة) (1/20) + الجسم المضاد الثانوي (1/200)).
- أضف السموم الداخلية المنخفضة ، الخالية من الأزيد (LEAF) بنسبة 1٪ إلى الخلايا (جميع الأنابيب) لمنع تفاعلات CD16 / CD32 مع مجال Fc للغلوبولين المناعي. احتضن الخلايا لمدة 10 دقائق مع تحريك لطيف كل 5 دقائق.
- أضف الجسم المضاد 4C4 (1/20) إلى الخلايا (الأنبوب 3) واحتضنه لمدة 30 دقيقة مع تحريك لطيف كل 10 دقائق.
- تدور الأنابيب عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية.
- يغسل مرة واحدة باستخدام 0.5 مل من Media A + 2٪ NGS ، ثم قم بتدوير الأنابيب عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق حبيبات الخلية مع 0.5 مل من الوسائط A + 2٪ NGS واحتضان الخلايا مع LEAF بنسبة 1٪ لمدة 10 دقائق مع تحريك لطيف كل 5 دقائق.
- أضف الجسم المضاد الثانوي (1/200) إلى الخلايا (الأنبوب 2 و 3). احتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة مع تحريك لطيف كل 10 دقائق وحماية من الضوء.
- تدور الأنابيب عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية.
- اغسل مرتين باستخدام 0.5 مل من الوسائط A + 2٪ NGS, ثم أعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من الوسائط A + 2٪ NGS.
- قم بتشغيل تعليق الخلية من خلال غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر وقم بنقلها إلى فرز الخلايا الباردة المنشطة بالفلورة سعة 5 مل أو أنابيب FACS على الجليد ، محمية من الضوء.
< p class = "jove_title" >
2. فرز الخلايا (FACS)
ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية.
- فرز الخلايا العصبية والضامة / الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام FACS.
ملاحظة: عادة ما يقوم بتنفيذ هذه الخطوة موظف في مرفق FACS وتعتمد الإعدادات على نوع المعدات المستخدمة.
- أضف DAPI بتركيز 1 ميكروغرام / مل في كل أنبوب FACS لتسمية الخلايا الميتة.
- قم بإعداد FACS وفرز الخلايا العصبية أو البلاعم / الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا الدبقية الصغيرة من جميع خلايا الدماغ. افصل الخلايا عن الحطام من حيث حجمها وحدبتها ، ثم قم بتوصيل الخلايا المفردة عن طريق التشتت الأمامي والتشتت الجانبي. استبعاد الخلايا الميتة عن طريق وضع العلامات على DAPI من الخلايا الحية. تحديد الخلايا العصبية أو الضامة / الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تلطيخها الإيجابي.
- اجمع الخلايا في أنابيب سعة 1.5 مل تحتوي على 1 مل من الوسائط المثلجة A + 2٪ NGS على الجليد. استخدم أنابيب مختلفة لكل نوع من أنواع الخلايا.
- تدور الأنابيب عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ثم تخلص من المادة الطافية.
- اغسلها مرة واحدة باستخدام 0.5 مل من الوسائط A ثم تخلص من الحد الأقصى للمادة الطافية.