ضربة قاضية جينية بوساطة الحمض النووي الريبي القصيرة في iHSPCs في المختبر: يتم تسليم نظام تعبير الحمض النووي الريبي shRNA القائم على فيروس الونس إلى iHSPCs للتخلص من التعبير الجيني المحدد

الملخص

المصدر: Hsiao ، Y. L. ، et al. دراسة تطور الخلايا المتغصنة عن طريق ضربة قاضية جينية بوساطة الحمض النووي الريبي قصير الدبوس في جذع الدم المكونة للدم وخط الخلية السلفية في المختبر. J. Vis. Exp. (2022).

في هذا الفيديو ، نوضح طريقة لإجراء نقل نواقل shRNA الفيروسية للحصول على خطوط خلية قاضية مستقرة في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (iHSPCs).

البروتوكول

p class = "jove_title" >1. تحضير خطوط الخلايا الجذعية السلفية المكونة للدم (iHSPCs)

1. الحفاظ على خط خلايا iHSPC في وسط RPMI 1640 كامل يحتوي على 100 نانوغرام / مل FL و 1 ميكرومتر β-استراديول.
2. قم بتمرير الخلايا بنسبة 1:10 كل 3 أيام.
   ملاحظه: اصنع متوسط RPMI 1640 كاملا عن طريق مكملات مصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ ، و 5 × ^10-5 M β-mercaptoethanol ، و 10 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. الفئران المؤتلف FL متاح تجاريا أيضا.

< p class = "jove_title" >2. نقل الفيروسات العدسية

1. لوحة iHSPCs بكثافة 1 × 10⁵ خلايا / بئر في ألواح 12 بئر في 1 مل من الوسط الكامل الذي يحتوي على 100 نانوغرام / مل FL ، و 1 ميكرومتر β استراديول ، و 8 ميكروغرام / مل بوليبرين.
   ملاحظه: يعتمد تركيز البوليبرين على أنواع الخلايا وعادة ما يكون في حدود 4-8 ميكروغرام / مل.
2. أضف فيروس العدسات الحامل ل shRNA في كل بئر بتعدد العدوى (MOI) يبلغ 100.
   ملاحظه: ناقل الفيروس العسسي هو pLKO.1-Puro مع علامة اختيار بورومايسين (الشكل 1). يتم سرد التسلسلات المستهدفة ل shRNAs مقابل LacZ و Tcf4 و Id2 ، على التوالي ، في جدول المواد. يتم تعريف وزارة الداخلية من خلال عدد الفيروسات التي تتم إضافتها لكل خلية أثناء الإصابة.
   
3. قم بتدوير الألواح عند 1,100 × جم لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
4. احتضان الصفيحة التي تحتوي على خلايا مصابة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
   ملاحظه: إذا كانت الخلايا حساسة للبولي برين ، فقم بتحديث الخلايا بالوسط الكامل بدون البوليبرين بعد عدوى الدوران.
5. قم بتحديث الخلايا بوسط كامل يحتوي على 100 نانوغرام / مل FL و 1 ميكرومتر β-استراديول بعد 24 ساعة من الإصابة.
6. أضف 6 ميكروغرام / مل من بورومايسين إلى الوسط لتحديد الخلايا المصابة بعد 24 ساعة إضافية < br / > ملاحظه: عادة ما يستغرق ناقل الفيروسات العدسية المنقول 48 ساعة للتعبير عن الجينات ، بما في ذلك الجينات المقاومة للبورومايسين. تأكد من تحسين تركيز البيرومايسين لكل خط خلية.
7. قم بتحديث وسط الاختيار الذي يحتوي على 100 نانوغرام / مل FL و 1 ميكرومتر β-استراديول و 6 ميكروغرام / مل بورومايسين كل 3 أيام وحافظ على الخلايا لمدة أسبوع واحد على الأقل لتوسيع خلايا iHSPC المنقولة بثبات.
   ملاحظه: عادة ما يسري اختيار بوروميسين بعد 48 ساعة ، وتعتمد فترة الاختيار على أنواع الخلايا.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: بناء ناقل الفيروسات العدسية pLKO.1-Puro.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 مل أنبوب صغير إكستراجين أنبوب-170-ج 12 بئر لوحة معالجة بزراعة الأنسجة صقر 353043 مصل الأبقار الجنينية (FBS) كورنينج 35-010-السيرة الذاتية RPMI 1640 متوسط جيبكو 11875-085 β استراديول سيجما ألدريتش E2758-250 ملغ β-mercaptoethanol (β-ME) سيجما ألدريتش M6250 Flt3 ligand (فلوريدا) محلي الصنع بوليبرين سيجما ألدريتش TR-1003-G بوروميسين إنفيفوجين النمل PR-1 shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) اتحاد RNAi (TRC) shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT / TRCN0000072224) اتحاد RNAi (TRC) shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) اتحاد RNAi (TRC)