تحرير جينوم كريسبر الكل في واحد: طريقة للإصلاح الجيني الموجه بالتماثل في الخلايا المستنبتة باستخدام نظام CRISPR-Cas9

الملخص

المصدر: Zhang ، L. et al ، Gene Knock-in بواسطة CRISPR / Cas9 وفرز الخلايا في البلاعم وخطوط الخلايا التائية. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نوضح تحرير الجينوم الكل في واحد القائم على CRISPR-Cas9 في الخلايا المستنبتة حيث يتم توفير Cas9 و sgRNA كبناء بلازميد واحد للخلايا. تم إدخال نظام CRISPR-Cas9 والجين المطلوب إدخاله في الخلايا من خلال تقنية التثقيب الكهربائي لتسهيل التحرير الجيني الناجح.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التثقيب الكهربائي لخطوط البلاعم والخلايا التائية

1. تحضير مزارع الخلايا للتثقيب الكهربائي
   1. تحضير معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 مكملا بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS) كوسيط نمو كامل لخلايا Jurkat T. قم بإعداد وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع FBS بنسبة 10٪ لزراعة البلاعم RAW264.7. استكمل جميع وسائط النمو الكاملة ب 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (Pen / Strepe) باستثناء الوسائط المستخدمة في حضانة ما بعد التعدي قبل فرز الخلايا.
   2. قم بإجراء الزراعة الفرعية لخلايا RAW264.7 و Jurkat T وفقا لتعليمات المورد (انظر جدول المواد). عند زراعة خلايا RAW264.7 ، استخدم محلول التربسين-EDTA (0.25٪) لفصل الخلايا. استخدم FBS المكمل بنسبة 10٪ (حجم/حجم) DMSO كوسيط حفظ بالتبريد لخلايا RAW264.7 وJurkat.
   3. اجمع الخلايا بوزن 250 × جم لمدة 5 دقائق للبلاعم RAW264.7 و 90 × جم لمدة 8 دقائق لخلايا Jurkat T. ثم يغسل ب 5-10 مل من 1× DPBS (بدون أيونات Ca²⁺ أو Mg²⁺). قم بإزالة DPBS.
   4. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام 2 مل من 1× DPBS. استخدم 10 ميكرولتر من الخلايا واخلطها بحجم متساو من 0.2٪ تريبان بلو لتقدير عدد الخلايا وقابليتها للحياة.
      ملاحظه: تأكد من أن ثقافة الخلية تتمتع بصلاحية >90٪ في يوم التعدي
   .
   5. لتجربة ضربة واحدة ، قم بإجراء التثقيب الكهربائي باستخدام 10 ميكرولتر من أطراف النواة مع خمسة تكرارات. احسب الحجم المطلوب ل 2.0 × 106 خلية وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي. اغسل حبيبات الخلية مرة أخرى باستخدام 1× DPBS كما هو موضح في الخطوة 1.1.2.
      ملاحظه: عند استخدام 10 ميكرولتر أطراف نوة ، هناك حاجة إلى 4.0 × 10⁵ خلايا لكل تثقيب كهربائي. وفقا لذلك ، قم بإعداد ما لا يقل عن 2.0 × 10⁶ خلايا لتجربة واحدة.
   6. قم بإعداد طبق من 24 بئرا مع 0.5 مل من وسط النمو الكامل (محضر في الخطوة 1.1.1) لكل بئر بدون قلم / بكتيريا وتسخين في حاضنة 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >2. التثقيب الكهربائي لمكونات CRISPR / Cas9 وناقل الاستهداف

1. قم بتشغيل نظام التثقيب الكهربائي. استخدم معلمات التثقيب الكهربائي المحسنة على النحو التالي: 1,400 فولت / 20 مللي ثانية / 2 نبضات للبلاعم RAW264.7 و 1350 فولت / 20 مللي ثانية / 2 نبضات لخلايا Jurkat T.
2. مع مراعاة فقدان العينة بسبب سحب العينة ، قم بإعداد خليط التثقيب الكهربائي سعة 55 ميكرولتر في أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 2.5 ميكروغرام من كل ناقل CRISPR / Cas9 (pDsR-mR26-sg1 و pDsR-mR26-sg2 ل mRosa26 موضع ضربة ، و pDsR-hR26-sg1 و pDsR-hR26-sg2 لموضع hROSA26) ، 2.4 ميكروغرام من متجه الاستهداف الخطي (pKR26-POI-iBFP أو pKhR26-POI-iBFP ل mRosa26 و hROSA26ضربة ، خطية بواسطة EcoRI أو BamHI) ، و Resuspension Buffer R.
   ملاحظه: لتوفير الوقت ، يمكن تحضير خليط التثقيب الكهربائي أثناء الطرد المركزي (الخطوة 1.1.5).
3. أعد تعليق 2.0 × 10⁶ خلايا (محضرة في الخطوة 1.1.5) في خليط التثقيب الكهربائي سعة 55 ميكرولتر من الخطوة 1.2.2.
4. استنشق خليط الخلية / التثقيب الكهربائي من الخطوة 1.2.3 باستخدام طرف نوكليوفكتيون سعة 10 ميكرولتر باستخدام ماصة.
   ملاحظه: أثناء سحب العينات، تجنب إدخال فقاعات الهواء، التي قد تتسبب في فشل التثقيب الكهربائي.
5. أضف العينة إلى أنبوب مملوء ب 3 مل من Buffer E من مجموعة التثقيب الكهربائي.
6. قم بتطبيق معلمات التثقيب الكهربائي لنوعي الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.
7. انقل العينة إلى بئر واحد من الصفيحة المكونة من 24 بئرا مع وسط مسخن مسبقا من الخطوة 1.1.6.
8. كرر الخطوات 1.2.4-1.2.7 للتكرارات الأربعة الأخرى وكذلك لمتجه الاستهداف فقط وعناصر التحكم فقط متجه تعبير CRISPR.
   ملاحظه: قم بتغيير طرف النواة والأنبوب عند التبديل إلى نوع خلية / حمض نووي بلازميد مختلف.
9. قم بزراعة الخلايا المنقولة لمدة 48-72 ساعة للسماح بالتعافي بعد التثقيب الكهربائي والتعبير عن مكونات CRISPR / Cas9 قبل تحليل قياس التدفق الخلوي أو فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أمبيسلين ، ملح الصوديوم MP الطب الحيوي 194526 عداد الخلوي الصغير الآلي للخلايا نكسلم بيوساينس DPBS (10X) ، خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم ثيرموفيشر العلمي 14200075 وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوز HyClone SH30022.01 فالكون 5 مل البوليسترين أنبوب اختبار القاع المستدير BD Biosciences 352003 مصل الأبقار الجنينية (FBS) ثيرموفيشر العلمي 10099141 جوركات ATCC TIB-152 https://www.atcc.org/ كبريتات الكاناميسين MP الطب الحيوي 194531 ماصة متعددة القنوات (30-300 ميكرولتر) Eppendorf ، أو ما شابه ذلك نظام تعداء النيون ثيرموفيشر العلمي MPK5000 نظام تعداء النيون ، طقم 10 ميكرولتر ثيرموفيشر العلمي MPK1096 Nunc 15 مل أنابيب الطرد المركزي المعقمة المخروطية ثيرموفيشر العلمي 339651 طرف الماصة 0.1-20 ميكرولتر Eppendorf ، أو ما شابه ذلك 0030 075.005 طرف الماصة 2-200 ميكرولتر Eppendorf ، أو ما شابه ذلك 0030 075.021 طرف الماصة 50-1000 ميكرولتر Eppendorf ، أو ما شابه ذلك 0030 075.064 pX458-DsRed2 أدجين 112219 RAW264.7 ATCC TIB-71 https://www.atcc.org/ RPMI 1640 متوسط HyClone SH30027.01 البنسلين - ستربتومايسين ثيرموفيشر العلمي 15140122 محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪ ثيرموفيشر العلمي 15250061 1.5 مل أنابيب دقيقة ، PCR نظيفة Eppendorf ، أو ما شابه ذلك 0030 125.215 24 بئر شفاف TC معالج لوحات الآبار المتعددة كورنينج 3524