$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. تحضير الخلايا الجذعية للتحرير
- قم بزراعة وزراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) على صفيحة مكونة من 6 آبار تحتوي على 2.4 × 106 خلايا / صفيحة من مغذيات الخلايا الليفية الجنينية المعطلة للفأر (MEF) المزروعة على الجيلاتين. الحفاظ على hPSCs في 3 مل من وسائط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لكل بئر (وسائط hESC) وتنمو في حاضنة 37 درجة مئوية مع 3٪ O2/5٪ CO2.
ملاحظه: لنجاح هذا البروتوكول ، ليس من الضروري الحفاظ على hPSCs في حاضنة منخفضة الأكسجين. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن hPSCs تتكاثر بشكل أسرع في بيئة O2 عالية ، لذلك يجب تعديل الأوقات وأرقام الخلايا وفقا لذلك. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن hPSCs المحفوظة في الأكسجين المنخفض لها معدلات أقل من التمايز التلقائي.
- لعمل 500 مل من وسائط hESC ، امزج 380 مل DMEM / F12 ، 75 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، 25 مل من مصل الضربة القاضية (KSR). أضف الجلوتامين (التركيز النهائي 1 مليمتر) ، 5 مل 100x أحماض أمينية غير أساسية ، 100 وحدة / مل بنسلين ستربتومايسين (P / S) ، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) (4 نانوغرام / مل التركيز النهائي) ، و 2-ميركابتو إيثانول (التركيز النهائي 5.5 ميكرومتر).
- قم بتغيير الوسائط عن طريق إزالة الحجم الكامل للوسائط (3 مل) باستخدام ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية. استبدلها بوسائط hESC دافئة سعة 3 مل باستخدام ماصة مصلية. كرر تغيير الوسائط كل يوم حتى تتماسك hPSCs بنسبة 50٪ تقريبا (اليوم 1).
- قبل يوم واحد من الاستهداف (اليوم 1) ، قم بتغيير وسائط hESC ، وإزالة الوسائط القديمة وإضافة وسائط hESC دافئة مكملة ب 10 ميكرومتر Y-27632.
- أيضا في اليوم -1 ، قم بإعداد واحد إلى لوحين من 6 بئر أو 10 سم من خلايا التغذية MEF المقاومة للأدوية من الفئران DR4 (2.4 × 106 خلايا / لوحة).
ملاحظة: بشكل عام ، تعتبر 6 ألواح آبار مفيدة على ألواح 10 سم ، لأنها تستوعب المزيد من الوسائط. تضمن 6 ألواح آبار أيضا أن المستنسخة المختلفة من الآبار المختلفة مستقلة. ومع ذلك ، فإن اللوحة مقاس 10 سم ستسمح بالانتقاء بسهولة ، اعتمادا على المجهر المتاح لهذه العملية.
< p class = "jove_title" >
2. تحرير الخلايا الجذعية متعددة القدرات
- قم بإعداد محاليل التعدين عن طريق سحب 5 ميكروغرام لكل من ZFN 1 و 2 (الشكل 1) في أنبوب سعة 1.5 مل. الماصة 30 ميكروغرام من بلازميد الإصلاح في هذا الأنبوب أيضا. أخيرا ، قم بإدخال ماصة 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في الأنبوب لرفع الحجم إلى 300 ميكرولتر
ملاحظه: قم بإعداد البلازميدات كمتوسط التردد (أي مجموعة مناسبة) بتركيز لا يقل عن 300 نانوغرام / ميكرولتر من أجل الحفاظ على الحجم الكلي لمحلول التعدي أقل من 300 ميكرولتر. ليس من الضروري إجراء استخراج الفينول / الكلوروفورم ، أو خطية البلازميد ، أو استخدام مجموعة إعداد البلازميد الخالية من السموم الداخلية.
- قم بإزالة الوسائط من hPSCs باستخدام ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية. ماصة 2 مل دافئة 1x PBS في كل بئر لغسل الخلايا.
- قم بإزالة PBS على الفور باستخدام ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية. أضف 0.5 مل 0.25٪ محلول Trypsin-EDTA مباشرة على الخلايا في كل بئر. ضعها في الحاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2/3٪ درجةحرارة 2) لمدة 10 دقائق تقريبا أو حتى تبدأ طبقة التغذية في الرفع عن اللوحة.
- أضف 2 مل من وسائط esWash الدافئة (470 مل DMEM / F12 ، 25 مل FBS ، 100 وحدة / مل P / S) إلى كل بئر لإيقاف تفاعل التربسين.
- تأكد من أن خلايا التغذية تؤتي ثمارها على شكل ورقة. ماصة محتويات كل بئر في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مل ، يجمع بين جميع الآبار. قم بعمل الخلايا الثلاثية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. ليس من الضروري تفكيك طبقة التغذية ؛ سوف تخرج hPSCs من طبقة التغذية عن طريق التخلي اللطيف. يجب أن يكون هناك حوالي 15 مل من تعليق الخلية.
- أضف 25 مل من وسائط esWash إلى الأنبوب لرفع الحجم إلى 40 مل إجمالا. اترك قطع التغذية الكبيرة تستقر في قاع الأنبوب لمدة 1-2 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية (~ 38 مل) من الأنبوب باستخدام ماصة مصلية وقم بإيداعها في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
- قم بالدوران لمدة 5 دقائق عند 190 × جم. قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب باستخدام ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية. تأكد من عدم إزعاج بيليه الخلية. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر 1x PBS. يمزج مع محلول تعداء البلازميد المحضر مسبقا. عد الخلايا في هذه الخطوة. استخدم 5-10 ملايين خلية لكل تثقيب كهربائي.
- ماصة التعليق 800 ميكرولتر بالكامل في كوفيت التثقيب الكهربائي مقاس 4 مم ، ضعه على الجليد لمدة 3-5 دقائق∞. بعد التثقيب الكهربائي ، ضع الكوفيت مرة أخرى على الثلج لمدة 3 دقائق < / >
ملاحظه: راقب الثابت الزمني للتثقيب الكهربائي على نظام التثقيب الكهربائي. يختلف الثابت الزمني باختلاف عدد الخلية ونقاء الحمض النووي. عادة ما يكون للتعدين الناجح ثابت زمني بين 10-14 مللي ثانية عند استخدام الشروط المذكورة والنبض الجيني II. يمكن أن تحدث كفاءة التثقيب الكهربائي المنخفضة عندما تختلف ثوابت الوقت عن هذه القيم.
- أعد تعليق الخلايا الكهربائية في 18 مل من وسائط hESC الدافئة المكملة ب 10 ميكرومتر Y-27632. لوحة 3 مل من هذا المعلق أحادي الخلية في كل بئر من 6 آبار مع خلايا تغذية DR4. العودة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2/3٪ O2).
3. اختيار المستعمرات الإيجابية
- اليوم 2 ، قم بإزالة جميع الوسائط باستخدام ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية. استبدل ب 3 مل من وسائط hESC الدافئة المكملة ب 10 ميكرومتر Y-27632. اليوم 3، قم بإزالة جميع الوسائط باستخدام ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية. استبدل ب 3 مل من وسائط hESC الدافئة دون تضمين Y-27632. اليوم 4 ، قم بإزالة جميع الوسائط باستخدام ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية. استبدل ب 3 مل من وسائط hESC الدافئة المكملة بالمضادات الحيوية للاختيار. العودة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2/3٪ O2) .
ملاحظه: يعتمد نوع المضاد الحيوي المستخدم على كاسيت المقاومة المضمن في قالب الإصلاح. عند العمل مع WIBR # 3 hPSCs (سجل المعاهد الوطنية للصحة 0079) ، تم استخدام 0.5 ميكروغرام / مل بورومايسين ، و 70 ميكروغرام / مل G418 (جينتيسين) ، و 35 ميكروغرام / مل هيغروميسين بنجاح. يجب تحديد تركيزات الانتقاء تجريبيا عن طريق تحديد الحد الأدنى من تركيز المضادات الحيوية اللازمة لقتل الخلايا البرية في غضون أسبوع تقريبا.
- الأيام 5-12 ، قم بتغيير الوسائط يوميا ، واستبدل الوسائط القديمة في كل مرة بوسائط hESC دافئة مكملة بالمضادات الحيوية.
ملاحظه: توقع كمية كبيرة من موت الخلايا. ستظهر المستعمرات الفردية في حوالي اليوم 8-10. يمكن استخدام وسائط hESC العادية بدون مضادات حيوية بعد 12-14 يوما من الاختيار المستمر. إذا كانت كثافة الخلايا عالية أو كان موت الخلايا بطيئا ، فيجب تجنب تحمض الوسائط وقد يكون من الضروري زيادة حجم الوسائط (حتى 4-5 مل) خلال الأيام القليلة الأولى من الاختيار.
