التكامل الجيني المستهدف بوساطة TALEN: استخدام نوكليازات هندسية خاصة بالتسلسل من أجل الإدخال الدقيق لجين البروتين الفلوري في hiPSCs

Abstract

المصدر: Cerbini، T. et al. تعداء واختيار واختيار مستعمرة للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان التي تستهدف TALEN بجين GFP في الملاذ الآمن AAVS1. J. Vis. Exp. (2015)

يصف هذا الفيديو تقنية دقيقة لتحرير الجينوم في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية ، أو hiPSCs ، باستخدام TALENs لإنشاء فواصل مزدوجة الشريطة في موضع مستهدف ، مما يؤدي إلى إصلاح موجه بالتماثل لتكامل جينات البروتين الفلوري.

Protocol

فئة < ص = "jove_title" >1. تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء الأواني البلاستيكية

1. ضع مخزون مصفوفة الغشاء القاعدي المجمد من -20 درجة مئوية على الجليد وقم بإذابة الثلج طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. بعد الذوبان ، قم بتقطيع الماصة 2 مجم من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى أنابيب eppendorf المبردة مسبقا. قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
3. لتحضير ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاعدي ، قم بإذابة قطعة واحدة على الجليد حتى تختفي آخر قطعة من الجليد في أنبوب eppendorf (عادة في غضون ~ 2 ساعة).
4. بعد الذوبان ، أضف مصفوفة الغشاء القاعدي إلى 12 مل من DMEM / F12 البارد (4 درجات مئوية) لعمل محلول طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي.
5. أضف محلول مصفوفة الغشاء القاعدي إلى وعاء الاستزراع المناسب. للحصول على طبق مكون من 6 آبار ، قم بتوزيع 1 مل لكل بئر. قم بتدوير اللوحة للتأكد من أن محلول مصفوفة الغشاء القاعدي يغطي كل بئر بالكامل.
6. يغلق البارافيلم الصفيحة / الطبق المطلي بالمصفوفة الغشاء السفلي ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة قبل الاستخدام. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الأطباق / الأطباق المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي في درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدمها في غضون أسبوعين من الطلاء.
   ملاحظه: أضف DMEM / F12 إضافيا إلى اللوحة / الطبق المطلي بمصفوفة الغشاء السفلي لمنع الجفاف. قبل استخدام لوح / طبق مطلي بمصفوفة غشاء الطابق السفلي المخزنة بمقدار 4 درجات مئوية ، ضعه في خزانة أمان بيولوجية واتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
7. شفط مصفوفة الغشاء القاعدي تماما قبل إضافة الوسط والخلايا.

< p class = "jove_title" >2. تحضير E8 medium

1. تحضير وسط استزراع E8 عن طريق إذابة مكمل E8 طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. قم بإزالة 10 مل من الوسط القاعدي E8 من المرق سعة 500 مل وتخلص منه.
3. ضع قارورة 10 مل كاملة من مكمل E8 مباشرة في 490 مل من الوسط القاعدي E8. لا تقم بتسخين وسط E8 الكامل في حمام مائي 37 درجة مئوية ، لأن التقلبات المتكررة في درجات الحرارة يمكن أن تؤدي إلى تدهور bFGF في وسط E8 الكامل.
4. استخدم وسط E8 الكامل في غضون أسبوعين من إضافة الملحق.

< ص الفئة = "jove_title">3. ذوبان iPSCs

1. قم بإزالة قارورة iPSCs المجمدة من النيتروجين السائل ووضعها على الثلج الجاف.
قم
2. بإذابة القارورة بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية ؛ قم بتدوير القارورة في الحمام المائي حتى يتبقى جزء صغير فقط من الجليد.
3. رش القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول وانقلها إلى خزانة السلامة البيولوجية.
4. أضف 1 مل من درجة حرارة الغرفة E8 متوسطة بالتنقيط مباشرة إلى القارورة.
5. باستخدام ماصة سعة 2 مل ، انقل معلق الخلية بالتنقيط إلى 9 مل من وسط E8 في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتدوير الأنبوب بشكل متكرر للتأكد من اختلاط الخلايا والوسط جيدا بسرعة.
6. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
7. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في حجم مناسب من E8 مكملا ب 10 ميكرومتر Y-27632.
8. أضف الخلايا إلى عدد مناسب من الآبار المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي ، وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. يوصى بلوحة ما لا يقل عن 0.2 × 10⁶ iPSC لكل بئر من لوحة 6 آبار لتمكين الانتعاش السريع بعد الذوبان.

< p class = "jove_title" >4. الصيانة والمرور الروتيني ل iPSCs

1. قم بتحديث E8 متوسط يوميا.
2. مراقبة مورفولوجيا والتقاء الخلايا بمجهر مقلوب. تنمو iPSCs ذات الجودة العالية في مستعمرات مسطحة ذات حدود مميزة; تمتلك المستعمرات الفردية "مثل الحصى" مظهر.
3. تمرير خلايا iPSCs عندما تصل إلى ~ 70٪ التقاء.
4. قم بإعداد محلول تمرير EDTA عن طريق إضافة 0.9 جم كلوريد الصوديوم و 500 ميكرولتر 0.5 م EDTA إلى 500 مل DPBS. تخلط جيدا لإذابة كلوريد الصوديوم ، وفلتر بالمكنسة الكهربائية للتعقيم. قم بتسخين كمية من محلول المرور في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل المرور.
5. للمرور ، قم بشفط وسط الثقافة المستهلك وغسل الخلايا مرة واحدة بحجم متساو من محلول المرور الدافئ. قم بالشفط والماصة بما يكفي من محلول تمرير EDTA لتغطية الخلايا (1 مل لكل بئر من صفيحة 6 آبار).
6. ضع الخلايا تحت مجهر مقلوب وراقب مستعمرات iPSC. يجب أن يظهر ظهور الثقوب داخل المستعمرات والحدود المرتفعة في غضون 2 إلى 5 دقائق.
7. استنشق بعناية محلول تمرير EDTA.
8. باستخدام ماصة سعة 10 مل ، قم بتوزيع 4 مل من وسط E8 (في حالة استخدام صفيحة 6 آبار) تحت ضغط عال مباشرة في كل بئر ليتم تمريره.
9. جمع كتل iPSC وتقسيم إلى عدد مناسب من الآبار اعتمادا على نسبة الانقسام من 1:8 إلى 1:12. لا تفرط في استخدام الماصة، لأن تفكيك كتل الخلايا سيؤدي إلى ضعف قابلية البقاء.
10. ضع اللوحة في حاضنة ، وهز اللوحة ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر عدة مرات لتفريق الخلايا.

< p class = "jove_title" >5. تحضير MEFs و iPSCs للتعداء

1. 48 ساعة قبل تعداد, تمرير iPSCs في ~ 1:6 إلى أربعة أو أكثر من الآبار من لوحة 6 آبار مغلفة بغشاء القاعدي, بحيث تكون 70٪ التقاء يومين بعد ذلك.
2. في اليوم التالي ، قم بإذابة DR4 MEFs في وسط MEF يتكون من DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز) مكملة بنسبة 10٪ FBS و 1x MEM-NEAA.
3. ضع DR4 MEFs في طبقين بحجم 10 سم عند ~ 2 × 10 درجة مئوية خلية / سم² واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
4. في يوم التعداد, تغيير وسط MEF إلى E8 مكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 30 دقيقة قبل إجراء تعداء على iPSCs.
5. اختياري: 4 ساعات قبل التعدي، استكمل ثقافة iPSC قبل التعداء مع Y-27632 بالتركيز النهائي 10 ميكرومتر.

فئة < ص = "jove_title">6. علاج كاشف تفكك الخلايا اللطيفة وتعداء iPSCs باستخدام نظام التثقيب الكهربائي

1. قم بإزالة محلول تعداء الخلية الأولية P3 من 4 درجات مئوية واتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 30 دقيقة. أضف مكمل 100 ميكرولتر بالكامل إلى محلول التعداء قبل الاستخدام.
2. كاشف تفكك الخلايا اللطيفة الدافئ في حمام مائي 37 درجة مئوية.
3. الحصول على AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 و pZT-AAVS1-R1) و AAVS1-CAG-EGFP من -20 درجة مئوية.
4. قم بإزالة iPSCs من الحاضنة واغسلها مرة واحدة باستخدام DPBS.
5. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا اللطيفة لكل بئر واحتضان iPSCs عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق, أو حتى أكثر من 50٪ من الخلايا قد انفصلت عن وعاء الثقافة.
6. ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة p1000 لفصل أي خلايا متبقية من وعاء الاستزراع, وتفتيت كتل iPSC.
7. أضف 2 مل من وسط E8 إلى كل بئر وقم بالماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة سعة 10 مل لتقسيم كتل الخلايا إلى خلايا مفردة.
   ملاحظه: تنخفض كفاءة التعدي بشكل كبير إذا لم يتم تصنيف كتل الخلايا بشكل كاف.
8. جمع iPSCs في 15 أنبوب مخروطي مل, وأجهزة الطرد المركزي في 100 × ز ل 3 دقائق.
9. شفط الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا بكمية قليلة من وسط E8.
10. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم بعد وضع بقعة حيوية مثل 0.4٪ تريبان بلو. تأكد من أن الخلايا منفصلة بشكل كاف أثناء العد (1-3 خلايا لكل "كتلة").
11. قم بتوزيع 3 خلايا × 10 في كل من أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل ، وقم بالدوران مرة أخرى عند 100 × جم لمدة 3 دقائق < / > ملاحظه: يقلل الطرد المركزي منخفض السرعة من إجهاد الخلية ويسمح بسهولة إعادة تعليق iPSCs قبل التثقيب الكهربائي.
12. اضبط نظام التثقيب الكهربائي على البرنامج الخاص بنوع الخلية لخط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H9 (البرنامج CB-150).
13. بعد الطرد المركزي ، استنشق المادة الطافية من كريات الخلية. إلى حبيبات واحدة ، أضف 10 ميكروغرام من المتبرع بالموارد البشرية كعينة تحكم. أضف إلى الحبيبات الأخرى 10 ميكروغرام من المتبرع بالموارد البشرية ، جنبا إلى جنب مع 5 ميكروغرام من كل TALEN (pZT-AAVS1-L1 و pZT-AAVS1-R1) كعينة تجريبية.
14. أعد تعليق كل حبيبات خلية في 100 ميكرولتر من محلول تعداء الخلية الأولية P3 ، وانقلها إلى كوفيت.
15. قم بإجراء التعدي وأضف على الفور 500 ميكرولتر من وسط درجة حرارة الغرفة E8 إلى كل كوفيت.
16. نقل iPSCs المنقولة بالتنقيط إلى طبق واحد 10 سم يحتوي على DR4 MEFs أعدت في الخطوة 5.4.

Materials