Method Article

التكامل الجيني المستهدف بوساطة TALEN: استخدام نوكليازات هندسية خاصة بالتسلسل من أجل الإدخال الدقيق لجين البروتين الفلوري في hiPSCs

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Cerbini، T. et al. تعداء واختيار واختيار مستعمرة للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان التي تستهدف TALEN بجين GFP في الملاذ الآمن AAVS1. J. Vis. Exp. (2015)

يصف هذا الفيديو تقنية دقيقة لتحرير الجينوم في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية ، أو hiPSCs ، باستخدام TALENs لإنشاء فواصل مزدوجة الشريطة في موضع مستهدف ، مما يؤدي إلى إصلاح موجه بالتماثل لتكامل جينات البروتين الفلوري.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة < ص = "jove_title" >1. تحضير مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء الأواني البلاستيكية

  1. ضع مخزون مصفوفة الغشاء القاعدي المجمد من -20 درجة مئوية على الجليد وقم بإذابة الثلج طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  2. بعد الذوبان ، قم بتقطيع الماصة 2 مجم من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى أنابيب eppendorf المبردة مسبقا. قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
  3. لتحضير ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاعدي ، قم بإذابة قطعة واحدة على الجليد حتى تختفي آخر قطعة من الجليد في أنبوب eppendorf (عادة في غضون ~ 2 ساعة).
  4. بعد الذوبان ، أضف مصفوفة الغشاء القاعدي إلى 12 مل من DMEM / F12 البارد (4 درجات مئوية) لعمل محلول طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي.
  5. أضف محلول....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments مصفوفة غشاء أساسي لعامل النمو المخفض (GFR) من ماتريجل ، * خالية من LDEV ، 10 مل كورنينج 354230 يحفظ في -20 درجة مئوية. DMEM / F-12 تقنيات الحياة هاتف: 11320-033 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. Costar 6 Well Clear ألواح الآبار المتعددة المعالجة TC كورنينج 3506 [م] أساسي 8 متوسط تقنيات الحياة A1517001 يحفظ الوسط القاعدي عند 4 درجات مئوية. يحفظ المكملات الغذائية في -20 درجة مئوية. Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد توكرس 1254 تخزينها في درجة حرارة الغرفة. بمجرد إذابته في H2 O ، يخزن في -20 درجة مئوية. كلوريد الصوديوم سيغما S5886-500G UltraPure 0.5 M EDTA، درجة الحموضة 8.0 تقنيات الحياة هاتف: 15575-020 DPBS، خال من الكالسيوم والمغنيسيوم تقنيات الحياة 14190-250 طبق ثقافة معالج ب TC مقاس 100 مم كورنينج 430167 DR4 MEF 2M IRR - أكاديمي جلوبال ستيم جي اس سي-6204 جي يحفظ في النيتروجين السائل. DMEM, ارتفاع الجلوكوز, البيروفات تقنيات الحياة 11995-040 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. مصل الأبقار الجنيني المحدد ، من أصل أمريكي HyClone SH30070.03 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج عند 4 درجات مئوية طوال الليل وتناوله. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية لحين الحاجة. محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X) تقنيات الحياة 11140-050 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. 4D-Nucleofector الوحدة الأساسية لونزا AAF-1001B جزء من نظام التثقيب الكهربائي. وحدة 4D-Nucleofector X لونزا AAF-1001X جزء من نظام التثقيب الكهربائي. P3 خلية أولية 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) لونزا V4XP-3024 عند الوصول ، قم بإزالة محلول الخلية الأولية واستكمله وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. كاشف تفكك الخلايا StemPro Accutase تقنيات الحياة A1110501 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج طوال الليل عند 4 درجات مئوية وقم بتسخين كمية كبيرة في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. وسط ثقافة NutriStem XF / FF ستيمجنت 01-2005 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج طوال الليل عند 4 درجات مئوية AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 و pZT-AAVS1-R1) أدجين 52637 و 52638 AAVS1-CAG-EGFP متبرع بإعادة التركيب المتماثل أدجين هاتف: 22212 بوروميسين ثنائي هيدروكلوريد تقنيات الحياة أ11138-03 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قم بإعداد حصص العمل من 1 مجم / مل في ddH2O. ماصات البورسليكات الزجاجية المتاح فيشر ساينتيك 13-678-20 أ سورفال ليجند XTR (مبرد) ، 120 فولت 60 هرتز الترمو: العلمية 75-004-521 TX-750 4 × 750 مل دوار دلو متأرجح الترمو: العلمية 75003607 محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪ تقنيات الحياة 15250-061

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TALEN Mediated Gene IntegrationHuman Induced Pluripotent Stem CellsDouble Strand Break CreationHomology Directed RepairFluorescent Protein Gene InsertionAAVS1 Safe Harbor TargetingElectroporation Plasmid DeliveryAntibiotic Resistance SelectionTALEN Plasmid TransfectionDonor Plasmid Homology Arms

Related Articles