phiC31-تكامل الجينات المعدلة وراثيا الموجه بوساطة الموقع: تقنية حقن مجهري لتكامل الجينات المعدلة وراثيا في ناقل الأنوفيليس

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Adolfi ، A. ، Lynd ، A. ، Lysett ، G. J. ، James ، A. A. التكامل بوساطة φC31 الموجه بالموقع وتبادل الكاسيت في نواقل الأنوفيليس للملاريا. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نوضح تكامل الجينات المعدلة وراثيا الخاص بالموقع بوساطة phiC31 في جنين Anopheles عن طريق الحقن المجهري. تساعد هذه الطريقة في إدخال الجينات المرغوبة في نظام مضيف للبحث والتطبيقات الصناعية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير البلازميدات لمزيج الحقن المجهري

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يتضمن البروتوكول الموضح هنا استخدام اثنين من البلازميدات: attB (موقع التعلق المشتق من البكتيريا المضيفة) - بلازميد متبرع يحمل الجين المعدل المعني ، وبلازميد مساعد يعبر عن φC31 integrase بموجب تنظيم ذبابة الفاكهة Hsp70 المحفز.

1. قم بتنقية البلازميدات المانحة والمساعدة باستخدام مجموعة تنقية البلازميد الخالية من السموم الداخلية.
   ملاحظه: تسلسل مستحضر البلازميد النهائي المستخدم للحقن للتحقق من سلامة جميع المكونات.
2. اجمع بين الكميات المناسبة من البلازميدين للحصول على مزيج بتركيز نهائي يبلغ 350 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد المتبرع و 150 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد المساعد عند إعادة تعليقه في مخزن الحقن. < / > ملاحظه: عند حساب الحجم اللازم للخلط، ضع في اعتبارك أن 10-15 ميكرولتر كافية لكل يوم من الحقن المخطط لها ويمكن تحضير الحمض النووي مسبقا وتخزينه عند -20 درجة مئوية. كما تم الإبلاغ عن تركيزات البلازميد المساعد من الإنتجريز من 60-500 نانوغرام/ميكرولتر وتركيزات البلازميد المانحة من 85-200 نانوغرام/ميكرولتر.
3. قم بترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة 0.1 حجم من أسيتات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2) و 2.5 حجم من الثلج البارد 100٪ EtOH والدوامة. يجب أن يكون الراسب الأبيض مرئيا على الفور. إن وجود مستحضرات البلازميد الأولية عالية التركيز (أي ~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر) يحسن كفاءة هطول الأمطار. < / > ملاحظه: نقطة التوقف - يمكن تخزين الراسب عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
4. جهاز طرد مركزي عند 15,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات ب 1 مل من الثلج البارد 70٪ EtOH.
5. اغسل الحبيبات ب 1 مل من الثلج البارد 70٪ EtOH وأجهزة الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات وجففها في الهواء.
7. أعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت للحقن 1x (0.1 ملي مولار Na₃PO₄ ، 5 ملي مولار KCl ، درجة الحموضة 7.2 ، مرشح 0.22 ميكرومتر معقم) للوصول إلى تركيز نهائي إجمالي يبلغ 500 نانوغرام / ميكرولتر < br / > ملاحظه: افترض أن بعض الحمض النووي سيفقد أثناء عملية هطول الأمطار. لذلك ، أضف حجما أصغر من المخزن المؤقت للحقن أولا ، وتحقق من التركيز على مقياس الطيف الضوئي (على سبيل المثال ، Nanodrop) ، ثم أضف الحجم المتبقي المناسب للوصول إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر.
8. تأكد من إعادة تعليق الحمض النووي تماما ، وقم بإعداد حصص من 10-15 ميكرولتر لكل منها وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
9. في يوم الحقن ، قم بإذابة مادة واحدة وجهاز طرد مركزي عند 15,000 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة أي بقايا جسيمات. < / > ملاحظة: تتمثل إحدى الطرق البديلة لإزالة الجسيمات في تصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تجنب وجود بقايا الجسيمات في مزيج الحقن لأنها تؤدي إلى انسداد الإبرة أثناء الحقن المجهري للأجنة.

2. الحقن المجهري للأجنة من خط إرساء Anopheles

تغذية
1. الدم للبعوض البالغ من العمر 4-7 أيام من خط الالتحام المطلوب قبل 72 ساعة من الحقن المجهري (أي للحقن يومي الاثنين والثلاثاء إطعام الإناث في يوم الجمعة السابق ؛ للحقن يومي الخميس والجمعة إطعام الإناث يوم الاثنين من نفس الأسبوع).
بعوض من
2. النوع البري (WT) الذي يتغذى على الدم (أي البعوض الذي له نفس الخلفية الجينومية لخط الإرساء) في نفس اليوم ؛ ستكون هناك حاجة إلى البعوض من النوع البري (WT) في نفس اليوم ؛ ستكون هناك حاجة إليها للتهجين.
   ملاحظه: يؤثر حجم وجودة وجبة الدم على جودة البيض ، لذلك يوصى دائما باستخدام الدم الطازج (أي الدم المسحوب خلال الأيام السبعة السابقة). قد تؤدي تغذية الذراع أو التغذية على الفئران إلى زيادة جودة وكمية البيض ، ولكن لا يتم تشجيع هذه الطرق. ستكون البروتوكولات المحددة المعتمدة ضرورية للاستخدام البشري والحيواني.
3. إجراء الحقن المجهري للأجنة
   1. إجراء An. gambiae الحقن المجهري للأجنة في 25 ملي مولار كلوريد الصوديوم عن طريق استهداف القطب الخلفي للجنين بزاوية 45 درجة. للحصول على بروتوكول مفصل لجمع الأجنة والمحاذاة والحقن المجهري ، راجع Pondeville et al.و Lobo et al.
   2. إجراء الحقن المجهري للأجنة في زيت الهالوكربون 700:27 (2: 1) من خلال استهداف القطب الخلفي للجنين بزاوية 30 درجة. يمكن العثور على بروتوكول مفصل لجمع الأجنة ومحاذاتها والحقن المجهري في Terenius et al.و Lobo et al.
   3. انقل البيض مباشرة بعد الحقن في طبق بتري مملوء بالماء المقطر المعقم (الرقم الهيدروجيني 7.2) وأعده إلى الظروف الحشرية.
4. عند الفقس ، انقل يرقات G₀ إلى صينية بها ماء مقطر مملح (ملح منشط 0.1٪) يوميا وخلفها إلى الشرانق.
5. معدل فقس قياسي (أي عدد اليرقات المفرغة / عدد الأجنة المحقونة).
   ملاحظه: تساعد حركة الجنين على الفقس ، لذا فإن الدوران اللطيف أمر مرغوب فيه. يجب أن يبدأ الفقس ~ 48 ساعة بعد الحقن. نظرا لأن الحقن قد يسبب تأخيرا طفيفا في النمو ، فمن المستحسن الاستمرار في مراقبة اليرقات المتأخرة الفقس لمدة 3-4 أيام.

المواد