إسكات الجينات القائم على التداخل كريسبر: تقنية للقمع المستهدف لوظيفة الجينات في البريميات المسببة للأمراض

الملخص

المصدر: فرنانديز، إل جي في، وآخرون. تطبيق تداخل كريسبر (CRISPRi) لإسكات الجينات في الأنواع المسببة للأمراض من البريمياتسبيريا. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو إسكات الجين القائم على تداخل كريسبر في Leptospira المسببة للأمراض. يساعد القمع المستهدف للتعبير الجيني باستخدام نظام CRISPR / Cas الذي يمنع تكوين mRNA في تحديد الجينات المرشحة للدراسات المرضية والدوائية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تعريف Protospacer وبناء البلازميد

ملاحظة: في هذا القسم ، تم وصف الخطوة الأولى لاختيار الفواصل الأولية المناسبة لبناء sgRNA ومزيد من الربط في pMaOri.dCas9 (الشكل 1). يتكون تسلسل الفاصل الأولي هذا من تسلسل 20 نيوكليوتيد مقابل الهدف المطلوب.

1. احصل على تسلسل النيوكليوتيدات للجين المعني للإسكات في بنك الجين (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). أرسلها إلى خادم الويب CHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) ، مع تحديد المعلمات ل Streptococcus pyogenes Cas9 والفكرة المجاورة للفاصل الأولي NGG بعد تحديد "هدف Fasta". حدد المعلمات ل "CRISPR / Cas9" و PAM (الشكل المجاور للفاصل الأولي) NGG.
2. بناء على النتائج التي تم الحصول عليها ، حدد الفواصل الأولية ذات أفضل درجة ممكنة (السهم الأخضر) ، والتي تقع في أقرب مكان ممكن من نهاية 5 من منطقة الترميز ، والأهم من ذلك ، أنها موجودة في خيط القالب (ناقص) حيث يجب أن يقترن sgRNA بخيط الترميز للجين لإسكات الجينات الكاملة.
   ملاحظه: لا يتم تضمين شكل NGG في تسلسل sgRNA النهائي.
3. استخدم محفز lipL32 للتعبير عن الحمض النووي الريبي الإرشادي الفردي الذي يحتوي على تسلسل متغير 20 نيوكليوتيدات في نهاية 5 وتسلسل سقالة dCas9 محفوظ. ادمج التسلسل 20-nt ، المسمى protospacer ، مع محفز lipL32 (في نهايته 5 بوصات) وسقالة sgRNA (3'end) (الشكل 1 ب).
   ملاحظه: للحصول على مروج lipL32 محدد جيدا ، استخدم منطقة المروج التي تتكون من -334 إلى TSS (موقع بدء النسخ ، استنادا إلى Zhukova et al.). تحقق من الجدول 1 للحصول على كاسيت sgRNA النهائي.
4. قم بإنشاء كاسيت sgRNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتصنيعه بواسطة مزود تجاري.
5. بعد الحصول على الكاسيت ، قم بربطه في بلازميد pMaOri.dCas9 في موقع تقييد XmaI في كلا الطرفين (cccggg).
   1. قم بهضم كل من كاسيت sgRNA و pMaOri.dCas9 البلازميد مع إنزيم تقييد XmaI وانتقل إلى الربط (الشكل 1 ب).
   2. قم بتنفيذ خطوات الاستنساخ في dT auxotrophic بكتريا قولونية سلالة π1 ، بسبب أصل pMaOri (وبالتالي ، pMaOri.dCas9) للنسخ المتماثل ، R6K-gamma.
      ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصل للربط واختيار الاستنساخ ، راجع المنشورات السابقة لفرنانديز وناسيمنتو. سوف يرتبط dCas9 الموجه ب sgRNA بخيط الترميز للجين المعني المحدد ، وبالتالي سيعيق استطالة بوليميراز الحمض النووي الريبي (الشكل 1 ج) ، مما يؤدي إلى إسكات الجينات.

2. تحويل Leptospira عن طريق الاقتران

ملاحظة: يتم تقديم مخطط رسومي لهذه الخطوة في الشكل 2. لعمل وسائط HAN ولوحات HAN ، راجع Hornsby et al. و Fernandes et al.

1. تنمو خلايا Leptospira المسببة للأمراض عند 29 أو 37 درجة مئوية في وسائط HAN تحت التحريض عن طريق تخفيف ثقافة مشبعة في HAN طازج في 1:100 ؛ عادة ، L. interrogans serovar Copenhageni سلالة Fiocruz L1-130 يستغرق 4-6 أيام للوصول إلى كثافة الخلايا المناسبة.
   1. تأكد من وصول الثقافات إلى OD من 0.2-0.4 عند 420 نانومتر (2 إلى 5 × 10⁸ خلايا / مل) قبل استخدامها للاقتران.
      ملاحظه: نظرا لأن وسائط HAN يتغير لونها مع زيادة كثافة الخلايا (بسبب الفينول الأحمر الموجود في وسائط DMEM) ، فإن أجهزة الطرد المركزي (4,000 × جم ، 15 دقيقة ، درجة حرارة الغرفة) 1 مل من وسائط الثقافة لإزالة البريميات وتطبيق المادة الطافية كفارغة لقياس OD.
2. قم بتحويل الإشريكية القولونية المترافقة سلالة β2163 ، auxotrophic لحمض Diaminopimelic (DAP) ، مع البلازميد pMaOri.dCas9 الذي يحتوي على كاسيت sgRNA. لتحويل الإشريكية القولونية ، استخدم إما بروتوكولات الصدمة الحرارية أو التثقيب الكهربائي. قم بتضمين التحويل باستخدام البلازميد pMaOri.dCas9 بدون كاسيت sgRNA كعنصر تحكم.
   1. لتحويل الصدمة الحرارية ، امزج الحمض النووي البلازميد (100 نانوغرام) مع خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. قم بإجراء صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية وضعها مرة أخرى على الجليد لمدة 5 دقائق.
   2. للتثقيب الكهربائي ، استخدم الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية الممزوجة ب 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد. استخدم المعلمات التالية للنبض: 1.8 كيلو فولت ، 100 Ω ، و 25 ميكرو فهرنهايت ، استرجع الخلايا كما هو موضح أعلاه.
   3. قم بلوحة خلايا الإشريكية القولونية المانحة المحولة في وسط أجار LB المكملة بحمض ديامينوبيميليك (DAP) (0.3 مل) وسبيكتينومايسين (40 ميكروغرام / مل) لاختيار البلازميدات.
3. للاقتران ، حدد مستعمرة واحدة من كل صفيحة قبل يوم واحد من يوم الاقتران (والذي يتم تحديده من خلال مراقبة OD لثقافات leptospires).
   1. حدد مستعمرة واحدة من بكتريا قولونية β2163 من pMaOri.dCas9 الفارغة ، وواحدة من لوحات pMaOri.dCas9sgRNA. اسمح لهم بالنمو طوال الليل في 10 مل من LB بالإضافة إلى DAP و spectinomycin عند 37 درجة مئوية.
   2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافات المشبعة 1: 100 في 10 مل من LB الطازج بالإضافة إلى DAP (لا تقم بتضمين المضاد الحيوي هنا) حتى OD_{420 نانومتر} من 0.2-0.4. عادة ، يستغرق الأمر 2-3 ساعات حتى تصل الإشريكية القولونية إلى هذه الكثافات.
4. داخل غطاء السلامة الحيوية BSL2 ، قم بتجميع جهاز ترشيح عن طريق وضع مرشح غشاء استرات السليلوز المختلط بقطر 25 مم ، وحجم مسام 0.1 ميكرومتر ، في الجزء العلوي من القاعدة الزجاجية. ضع قمعا زجاجيا سعة 15 مل في الأعلى وامسك كلتا القطعتين بمشابك زنبركية. قم بتوصيل الزجاج بمضخة تفريغ وأضف الثقافات إلى القمع للترشيح.
5. أضف 5 مل من ثقافة Leptospira إلى القمع. أضف حجما من الإشريكية القولونية لتشكيل نسبة 1: 1 بناء على قيم OD_420nm لكلتا الثقافتين. قم بتشغيل مضخة التفريغ وتركيز الخلايا عن طريق الترشيح. بعد تركيز الخلية في مرشح الغشاء ، استرجعها بعناية. تأكد من ترشيح الوسيط من خلال الغشاء.
   ملاحظه: يستغرق الترشيح من 5 إلى 10 دقائق.
6. ضع المرشح على لوحة EMJH المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) مكملة ب DAP (0.3 ملليمتر). تأكد من أن جانب البكتيريا لأعلى. احتضان الألواح عند 29 درجة مئوية لمدة 24 ساعة < / > ملاحظه: إذا تم استخدام HAN أو لوحات EMJH الداخلية المكملة ، يمكن أن تتكاثر الإشريكية القولونية وتتغلب على النسبة المقصودة 1: 1 ، والتي بدورها يمكن أن تقلل من كفاءة الاقتران.
7. بعد 24 ساعة ، استرجع المرشحات من الألواح وضع كل مرشح فردي في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
8. استخدم 1 مل من وسط HAN السائل لتحرير الخلايا من سطح المرشح عن طريق سحب العينات والدوامة على نطاق واسع.
9. تصور المحاليل البكتيرية المختلطة المستردة عن طريق المجهر المجهري للمجال المظلم للتحقق من صلاحية الخلية وحركتها ، و Leptospira: نسب الإشريكية القولونية.
   ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن رؤية أعداد مكافئة من الإشريكية القولونية والبريمية.
10. انشر 100-200 ميكرولتر من هذه المزرعة على ألواح HAN تحتوي على 0.4٪ مصل أرنب معطل و 40 ميكروغرام / مل سبيكتينومايسين. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في جو 3٪ CO₂.
    قوي > ملاحظة: عادة ، L. interrogans serovar Copenhageni سلالة Fiocruz L1-130 تشكل خلايا Fiocruz L1-130 مستعمرات في 5-7 أيام على لوحات التحكم وفي 8-10 أيام على ألواح سبيكتينومايسين. في هذه المرحلة ، لن تنمو الإشريكية القولونية لأنها تغذية ل DAP.
11. كعنصر تحكم ، قم بتخفيف المزارع عند 10⁴ leptospires / مل وإضافة 100 ميكرولتر إلى الأطباق بدون مضادات حيوية ، لمراقبة نمو البريميات.

النتائج

يجب أن يكون كاسيت sgRNA:
cccgggGAACAAGAAAGAAAGAGTCAGATTTTTCTTACTACCGTCTTTGGAAATTTTCGGGATTTTAGTTTTGGTGACTGGTTGGTTGAAGCGATTTTTTCAAAAAAAAATAATCAATTTGTGTGTGTGTGTGTTGATTGATTGAAAACGCTTTTTTTTTTTTTTCTGATGTTTCAATCGTATAGAAATTCTATATATATATAATATCATCTTTTTTTTCTCTAAGACTTATATAACAATCGCTTTAAAACTCAAATTATAATCTTTTTTTTTCAGATAAAAAAATTATTCAATTTTTTTCAAAAAAATTCCTAAGTTCATACCGTGATTTTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGT...

المواد